施氮對不同有機碳水平桉樹林土壤微生物群落結構和功能的影響

蘇丹，張凱，陳法霖，李睿達，鄭華

中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室，北京100085

土壤微生物是土壤中營養周轉的主要參與者，對碳氮變化較為敏感。施氮及氮素的添加都可能影響土壤中微生物群落的變化，進而影響微生物群落功能和土壤營養過程。圍繞氮素施用對土壤微生物群落的影響已經開展了大量研究（Cusack等，2011；Waldrop等，2004；Zhong等，2010），并發現施氮可以改變土壤中主導微群落，由真菌主導的微生物群落轉化為細菌主導。Frey等施氮研究發現，真菌微生物量隨著氮的增加而降低，而細菌變化并不顯著(Frey等，2004)。微生物群落的變化——真菌和細菌比例等變化，可能導致參與木質素降解的真菌功能群豐度及土壤中酚氧化酶等酶活性降低，而改變土壤中有機物的代謝（Osono, 2007）。

土壤微生物群落同樣受到土壤中有機碳含量的影響，有機碳含量直接影響土壤微生物的生長，而影響土壤微生物群落豐度。其中有機質高的土壤中微生物量往往高于有機質低的土壤(Burger和Jackson，2003)。此外土壤有機物的組成中碳氮比影響土壤中微生物活性Hobbie, 1996），而影響微生物群落功能，如通過改變土壤酶活，影響土壤碳形態，最終影響土壤物質代謝。然而，在研究施氮水平對土壤微生物群落的影響時，很少考慮土壤有機碳水平的影響。

桉樹人工林是我國南方廣泛種植的經濟速生林，土壤養分缺乏(陳少雄，2009；廖觀榮，2003)。而氮肥的補充是維持桉樹養分的重要方式，則土壤中微生物群落及功能變化對營養周轉更為敏感。本研究以我國南方廣泛種植的桉樹人工林為研究對象，采用野外控制試驗的方法，探究不同土壤有機碳水平下施氮對桉樹林土壤微生物群落結構及功能的影響，其目標是：明確不同有機碳水平桉樹林土壤微生物群落對施氮水平的響應是否一致，并探討微生物群落變化在土壤養分維持中的意義。

1 研究區域概況與研究方法

1.1 研究區域概況

本研究樣地位于我國廣西扶綏縣國有東門林場（E107°15′～108°00′，N22°17′～22°30′）。廣西東門林場是亞洲最大的桉樹基因庫，主要經營以桉樹為主的商品用材林。該地區屬于北熱帶季風氣候區，光熱充足，雨熱同季，夏濕冬干，年平均氣溫21.2~22.3 ℃，1月均溫13.2 ℃，7月均溫27.9 ℃。年降雨量1100~1300 mm，主要集中在6—8月，占全年降雨量的51.03%。研究區域土壤以砂頁巖發育而成的赤紅壤為主，pH值在4.5~6.0。

1.2 實驗設計

為了研究不同有機碳水平桉樹林土壤微生物群落碳代謝功能對施氮的響應特征，本研究從預實驗的 20個樣地中，選取土壤有機碳含量差異顯著（P<0.01）的 2個二代桉樹林樣地：高有機碳樣地（HC）：有機碳含量 14.80 g·kg-1；低土壤有機碳樣地（LC）：有機碳含量12.89 g·kg-1），開展野外控制實驗。兩塊樣地平均坡度約為10°。林木行距4 m，

株距2 m，林下植被有桃金娘Rhodomyrtus tomentos、余甘子Phyllanthus emblica、三叉苦Euodi lepta、飛機草Eupatorium odoratum、白茅Imperata cylindrica等，植被覆蓋度為60%。樣地的基本特征見表1。

結合當地施肥習慣和施肥強度，在桉樹林樣地中設置3個施氮梯度：對照（CK，0 kg·hm-2）、常規氮（NN，166.8 kg·hm-2）和高氮（HN，333.7 kg·hm-2）。每個施氮水平設置重復 3個，每個樣方面積10 m×10 m。施氮時間為2013年5月20日，肥料種類為脲甲醛緩釋肥。取樣時間為 2013年 8月26日。

1.3 土壤理化性質測定及酶活測定

土壤理化性質測定參考土壤農化分析（鮑士旦，2000）。土壤總碳、總氮使用元素分析儀測定（Vario EL III，Elementar，Germany），有機碳含量用重鉻酸鉀滴定法（LYT 1237-1999），土壤pH值采用土水比(質量體積比)為1:2.5的方法測定。土壤可溶性有機碳由0.5 mol/L MK2SO4提取（H?gberg等2002；Jones和Willett，2006）并通過Liqui TOCⅡ分析儀（Elementar，Germany）測定，土壤酶活的測定參考DeForest熒光酶測定方法，及L-DOPA為底物酶培養測定方法（Deforest, 2009; Marx等，2001）。

1.4 磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty-acid Analysis，PLFA）提取、分離、鑒定

利用有機試劑對PLFA進行提取（氯仿、甲醇），分離（氯仿、甲醇、丙酮），甲酯化（甲醇、甲苯、正己烷）后，上機前用1 mL含內標物19:0的正己烷溶液溶解吹干的脂肪酸甲脂，進行 GC-MS（HP6890/MSD5793(Agilent Technologies，Bracknell，UK)）測試（陳法霖等，2012；Frosteg?rd 等，1996）。

1.5 數據分析

據表2將PLFA劃分不同的微生物類群，并計算細菌和真菌含量，及真菌與細菌的比例。

通過主成分分析及方差分析實現不同處理上土壤微生物群落結構的差異，由 CANOCO 5.0及SPSS 16.0統計軟件實現，畫圖工具為Excel。

表1 土壤基本性質Table 1 Property of the soil in the experiment

表2 微生物群落分類的PLFA標記Table 2 PLFA markers for taxonomic microbial groups

圖1 土壤微生物PLFA總量Fig.1 Soil microbial total PLFA

2 結果

2.1 土壤微生物群落PLFA總量

施氮顯著影響土壤微生物群落磷脂脂肪酸總量（P<0.01），施二倍氮素處理（HN）的土壤微生物磷脂脂肪酸總量顯著低于對照（CK）和常規施氮處理（NN）（圖1）。高有機碳水平土壤微生物群落磷脂脂肪酸生物量顯著高于低有機碳水平（P<0.01）。

土壤有機碳水平和施氮水平對土壤微生物群落磷脂脂肪酸總量的影響存在交互作用（P<0.01），高有機碳水平與對照、常規施氮水平和施二倍氮素組合的土壤微生物群落磷脂脂肪酸總量均顯著高于低有機碳水平與對照、常規施氮水平和施二倍氮素組合，低有機碳水平和施二倍氮素組合的土壤微生物群落磷脂脂肪酸總量顯著最低。

2.2 微生物群落結構

2.2.1 微生物群落組成

施氮顯著影響土壤細菌、真菌、放線菌磷脂脂肪酸量以及真菌/細菌比值，施二倍氮素處理的土壤細菌、放線菌磷脂脂肪酸量顯著低于對照和常規施氮處理；隨著施氮水平的增加，土壤真菌磷脂脂肪酸量和真菌/細菌比值顯著降低，對照、常規施氮水平和施二倍氮素處理之間土壤真菌磷脂脂肪酸量、真菌/細菌比值差異均達顯著水平（P<0.05）。高有機碳土壤細菌、真菌、放線菌磷脂脂肪酸生物量以及真菌/細菌比值均顯著高于低有機碳土壤處理（表3）。

土壤有機碳水平和施氮水平對土壤細菌、真菌、放線菌和真菌/細菌比值的影響存在交互作用，在低土壤有機碳水平中，施二倍氮素能顯著降低細菌磷脂脂肪酸量，但在高土壤有機碳水平中施氮對細菌磷脂脂肪酸量的影響不顯著。在低、高土壤有機碳水平中，真菌磷脂脂肪酸量對施氮的響應不一致，在低土壤有機碳水平中，常規施氮水平顯著降低了真菌磷脂脂肪酸量；而在高土壤有機碳水平中，施二倍氮素水平才顯著降低真菌磷脂脂肪酸量。在低、高土壤有機碳土壤中，常規施氮水平均顯著降低了土壤真菌/細菌比值。

2.2.2 微生物群落主成分分析

土壤微生物群落磷脂脂肪酸PLFA主成分分析表明：PC1可以解釋56.63%的變異，土壤微生物群落的差異主要表現在主成分1（PC1），即：不同有機碳水平下的土壤微生物群落；在2種有機碳水平上，高氮與其他處理之間分異均明顯（圖2）。

真菌特征脂肪酸 16:1ω5c、18:1ω9c、18:2ω9c及細菌特征脂肪酸16:1ω7c、i17:0和放線菌特征脂肪酸10Me18:0等與PC1顯著相關，而16:0、14:0、17:0、18:0在PC2上得分較高，這些脂肪酸對土壤微生物群落分異起到主要作用。

2.3 土壤酶活性及可溶性有機碳（DOC）特征

施氮顯著增加了土壤纖維素酶、酚氧化酶活性及土壤可溶性有機碳含量，施二倍氮素處理的土壤纖維素酶活性顯著高于對照和常規施氮水平處理；對照、常規施氮水平和施二倍氮素處理的酚氧化酶差異和土壤有機碳含量差異均顯著（P<0.05）（表4）。土壤有機碳水平也影響土壤纖維素酶活性和土壤可溶性有機碳含量，高土壤有機碳樣地中的土壤纖維素酶活性和土壤可溶性有機碳含量顯著高于低土壤有機碳樣地（表4）。

表3 土壤微生物群落組成1)Table 3 Soil microbial community composition

圖2 土壤微生物的群落結構主成分分析Fig.2 The principal components analysis of soil microbial community composition

表4 土壤酶活及DOC 含量Table 4 Soil extracellular enzymes activity and DOC content

施氮水平和土壤有機碳含量對土壤纖維素酶、酚氧化酶活性及土壤可溶性有機碳含量的影響存在交互作用。在低土壤有機碳樣地中，土壤纖維素酶活性對施氮的響應沒差異，但在高土壤有機碳樣地中，施二倍氮素處理的土壤纖維素酶活性顯著高于對照和常規施氮水平處理；在低土壤有機碳樣地中，常規施氮水平和施二倍氮素處理的酚氧化酶活性均顯著高于對照，而在高土壤有機碳樣地中，施二倍氮素處理的酚氧化酶顯著高于對照和常規施氮水平；對于土壤可溶性有機碳，低土壤有機碳樣地中，隨施氮水平的增加，土壤可溶性有機碳含量顯著增加，而在高土壤有機碳樣地中，施二倍氮素處理的土壤可溶性有機碳含量才顯著高于對照（表4）。

3 討論

土壤中氮可以通過調節微生物參與的碳氮代謝過程而影響微生物群落結構（DeForest等，2004）。本實驗發現施氮顯著影響了土壤微生物群落：（1）降低土壤微生物群落磷脂脂肪酸總量及土壤中細菌、真菌、放線菌磷脂脂肪酸量（P<0.05）。可能是因為外源氮的添加影響了土壤中微生物腐食食物鏈，而降低微生物對凋落物的吸收（Gan等2013），進而降低了土壤微生物的PLFA總量。氮添加處理后革蘭氏陽性及陰性菌、真菌豐度都降低，這與Bi等的實驗結果一致（Bi等，2012）。（2）施氮處理下，真菌/細菌比值顯著降低（P<0.05）。可能是施氮改變了土壤有機物的組成，而減少了真菌可利用有機物的比例，從而抑制了真菌的生長。Norris等認為土壤中外源氮的添加超過一定有效氮閾值，微生物真菌豐度降低，有真菌主導的微生物群落轉化為細菌主導（Janssens等，2010），進而改變土壤微生物分解功能（Norris等，2012；Wallenstein等，2006），同樣Tietema發現氮飽和土壤中真菌含量降低（Tietema等，1998），與本文實驗結果表現一致。

同時施氮土壤影響微生物群落進而調節了土壤中酶活，而影響土壤碳代謝過程（Sinsabaugh等，2005；Carreiro等2000）。本實驗發現施氮顯著增加了土壤纖維素酶、酚氧化酶活性及土壤中 DOC含量。酶活性在不同氮水平間的變化與相應微生物PLFA總量變化并不一致，可能是由于施氮主要是通過影響微生物功能群的變化而調節土壤酶活（Gallo等，2004）。而與此前報道（Frey等，2004）有差異的是，酚氧化酶活性并沒有受到氮的抑制，而是對氮做出正響應（P<0.05），說明施氮并沒有影響酚氧化酶的主要微生物功能群，其機制需要進一步通過分子生物學等方法探究。土壤可溶性有機碳（dissolved organic carbon, DOC）來源于微生物對凋落物等植物殘體及土壤有機物的分解，與微生物參與的代謝過程顯著相關（方華軍等，2007）。原因可能是兩個方面：從來源上來說，較高的纖維素酶活性能夠分解有機物成為DOC；而從損失上來說，DOC是土壤微生物的能量來源（Yano等，2000），HN處理下微生物總量降低，對DOC的利用降低，這兩方面最終結果表現為DOC總量的增加。

同時，本實驗發現土壤有機碳影響土壤微生物群落結構及功能。在不同有機碳水平土壤中，微生物總量變化顯著（P<0.01），高有機碳水平桉樹林土壤微生物PLFA高于低有機碳水平桉樹林，強調了土壤有機碳為微生物提供能量，而調節微生物的生長（Fontaine等，2004；劉來等，2013），而Williams發現土壤有機碳顯著影響微生物群落組成（Williams等，2013），與本實驗結果一致。不同有機碳水平影響了土壤微生物群落，從而影響土壤中酶活性及 DOC的變化，整體表現為高土壤有機碳水平上2種酶活性及DOC高于低土壤有機碳水平。

此外，本研究發現土壤微生物對施氮的響應受到有機碳的調節。低有機碳水平土壤中，微生物群落受到有機碳的限制，而對氮的添加更為敏感，在低氮（常規氮）水平上表現出群落結構及功能降低的趨勢。而在高土壤有機碳水平樣地中只有在高氮（施二倍氮素）處理中才顯著降低或不變化。在不同有機碳水平上，施氮可能改變了土壤的碳氮比，而表現為不同有機碳水平上微生物群落結構及功能的差異（Allison等，2008；Liu和 Greaver, 2010）。施氮傾向于引起土壤中碳氮比降低，當氮含量較豐富時，微生物可利用的有效氮增加，但是土壤中可利用的碳成為微生物的限制因素(Aber等，1989)，所以產生施氮條件下，土壤微生物整體豐度降低。而在高有機碳土壤中，有效碳的含量高，而土壤微生物對氮的響應，所表現出的碳的限制并不明顯。

本實驗結果表明施氮顯著影響了土壤中微生物群落結構及功能，同時，土壤微生物的響應又受到土壤有機碳的調節，而且不同有機碳水平上微生物群落及功能變化對氮的響應并不一致。不同施氮水平對人工林生態系統中土壤微生物的影響，應當考慮土壤中有機碳水平。

4 結論

通過對不同有機碳水平桉樹林土壤中微生物實驗的研究，我們得出以下結論。

（1）施氮顯著影響土壤微生物群落結構及功能，土壤微生物群落PLFA總量隨著施氮的增加反而降低。而且隨著施氮的增加，土壤微生物中真菌與細菌比例降低；而土壤微生物群落功能——土壤微生物酶活性，在施氮處理的影響下而增加，說明施氮促進部分微生物分解功能增強。

（2）土壤微生物群落結構以及功能的變化同時受到土壤中有機碳水平的調節，在高有機碳水平土壤中，微生物 PLFA量高于低有機碳水平，同時土壤微生物酶活性也表現出不同有機碳水平上的顯著差異，在高有機碳水平上酶活要高于低有機碳水平。

（3）施氮和土壤有機碳變化對土壤微生物的影響有交互作用，不同有機碳水平上，土壤微生物群落組成差異顯著，尤其是真菌含量，在低土壤有機碳水平中，常規施氮水平下真菌磷脂脂肪酸量顯著降低；而在高土壤有機碳水平中，施二倍氮素水平才顯著降低真菌磷脂脂肪酸量。而碳氮對不同酶活性的影響表現不同的交互作用，酚氧化酶，纖維素酶在高有機碳高氮條件下活性高于其他處理，施氮在高有機碳的水平條件下促進土壤微生物的分解功能。所以不同施氮水平對人工林生態系統中土壤微生物的影響研究，土壤中有機碳水平不容忽視。

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