SephadexLH-20純化紅松松球鱗片多酚及其體外抗氧化研究

李波，包怡紅，高鋒，王振宇,*

（1.東北林業大學林學院，哈爾濱 150040；2.黑龍江省農業科學院科研處，哈爾濱 150086；3. 黑龍江省農業科學院，哈爾濱 150086）

隨著自由基生物學與自由基醫學研究的迅速發展，現已證明自由基和人類多種疾病均有著密切關系。因此，從天然植物中尋找新的清除體內自由基的抗氧化劑日益成為研究熱點。多酚類物質作為植物抗氧化的主要活性成分之一，由于其來源廣泛、抗氧化活性強和安全性高等特點，一直備受關注。

近年來研究發現松科植物體內含有大量多酚類物質，該類物質具有很強的抗氧化活性。蘇曉雨等[1]從紅松種皮中提取的多酚對羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基都有很好的清除作用，Liazid等[2]從松樹種子中提取的多酚能阻止脂質過氧化，Jeong等[3]從松針中提取的多酚能抑制DNA的氧化損傷。

我國紅松資源豐富，但對其多酚類物質的研究還很少。紅松松球鱗片作為松子的副產物，常常被廢棄，因此有必要綜合開發利用該資源。本文在利用AB-8大孔樹脂純化紅松松球鱗片多酚的基礎上[4]，選擇Sephadex LH-20對其進一步純化，以期得到高純度多酚類物質，并對其體外抗氧化活性進行測定，為進一步揭示紅松松球鱗片多酚生物活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松球鱗片多酚的初級純化物：紅松松球鱗片粉末經乙醇提取和AB-8樹脂純化后的凍干粉，純度35.07%。Sephadex LH-20購自Pharmacia公司，DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenl)-1-picrylhydrazyl)、ABTS（2,2’-Azino-bis-(3-ethyl benzoth-iazoline-6-sulfonic acid）、BHT（2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol）購自Sigma公司，VC購自天津市天力化學試劑有限公司，EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二鈉）購自天津市科密歐化學試劑開發中心，新銅試劑購自天津市光復精細化工研究所，其他試劑均為國產分析純。

DK-8D型電熱恒溫水槽（上海一恒科學儀器有限公司）；SHB-ⅢG循環式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；RE-5205旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；FA2004型電子天平（上海天平儀器廠）；722型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；FD-1E-50冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；BSZ-160F電腦自動部份收集器（上海精科實業有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 多酚含量（濃度）的測定

以沒食子酸為標準品，配置成不同濃度的標準品溶液，各吸取1 mL試液于25 mL容量瓶中，分別加入福林酚試劑2 mL，充分振蕩后靜置3～4 min，加入10%碳酸鈉溶液10 mL，蒸餾水定容，50 ℃水浴1 h，測定765 nm處的吸光值[5]。測得標準曲線方程為：A=3.7955C+0.02，其中A表示吸光值，C表示沒食子酸濃度（mg/mL）。多酚含量計算公式如下：

式中，N為稀釋倍數，A′為1mL稀釋液的吸光值。

1.2.2 多酚純度的測定

稱取一定質量的凍干粉并復溶，按照公式（1）測得多酚濃度，其純度計算公式如下：

式中，V為凍干樣品復溶后溶液的體積（mL），A″為凍干樣品復溶后1mL溶液的吸光值，m為凍干樣品的質量（mg）。

1.2.3 Sephadex LH-20純化方法

取 20g Sephadex LH-20凝膠經溶脹預處理后，采用逐步沉降法裝柱，最后柱體積為72mL，其中柱長36cm，柱直徑1.6cm。取3ml濃度為50mg/mL的多酚樣品溶液上樣，待樣品液全部入柱后，用50%乙醇洗脫3倍柱體積，洗脫液流出速度0.8mL/min，每5min收集1管，共收集54管。對每管收集液進行紫外掃描，波長范圍200-400nm，將具有相同或相似峰型的收集液合并，得到不同的組分，凍干后測定各組分純度，選取高純度的多酚組分（High purity polyphenols，HPP）進行體外抗氧化試驗。

1.2.4 HPP清除DPPH自由基能力測定

參考Liu等[6]的方法。量取不同濃度的HPP樣液（10～100μg/mL）1mL于試管中，加入3mL濃度為0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，立即混勻，室溫下避光放置30min，517nm波長處測定吸光值A1；無水乙醇代替HPP樣液，測定吸光值A0；無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測定吸光值A2。按照式（3）計算清除率。

1.2.5 HPP清除ABTS自由基能力測定

參考Marino等[7]的方法。稱取一定量的ABTS和過硫酸鉀，分別配成濃度為7.4mmol/L和2.6mmol/L的溶液，按體積比1:1混合，室溫避光靜置12h，制得ABTS自由基儲備液，于 4℃條件下保存，臨用前稀釋至一定濃度作為工作液，使其在 734nm波長處的吸光值為0.700±0.020。準確量取不同濃度的HPP樣液（20～200μg/mL）0.1mL，加入ABTS自由基工作液2.9mL，室溫下避光反應6min后，測定734nm波長處的吸光值A1；蒸餾水代替HPP樣液，測定吸光值A0；蒸餾水代替ABTS自由基工作液，測定吸光值A2。按照式（3）計算清除率。

1.2.6 HPP清除羥自由基能力測定

參考李姣等[8]的方法。向離心管中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵溶液1mL和6mmol/L的過氧化氫溶液1mL，混勻后加入不同濃度的HPP樣液（0.1～1mg/mL）1mL，靜置10min后，加入6mmol/L的水楊酸溶液1mL，振蕩均勻后于37℃水浴30min，然后5000r/min離心 10min，取上清液于 510nm波長處測定吸光值 A1；蒸餾水代替 HPP樣液，測定吸光值A0；蒸餾水代替水楊酸，測定吸光值A2。按照式（3）計算清除率。

1.2.7 HPP還原鐵離子能力測定

采用鐵氰化鉀還原法[9]。量取不同濃度的HPP樣液（30～300μg/mL）0.5mL于離心管中，分別加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖液（PBS）1.25mL、1%的鐵氰化鉀溶液1.25mL，混均后于50℃水浴20min，冷卻后加入10%的三氯乙酸溶液 1.25mL，充分振蕩后5000r/min離心 10min。取離心后的上清液 1.25mL，依次加入蒸餾水 1.25mL、0.1%的三氯化鐵溶液0.5mL，混勻后靜置10min，于700nm波長處測定其吸光值A1；蒸餾水代替HPP樣液，測定吸光值A2。按照式（4）計算還原力。

1.2.8 HPP還原銅離子能力測定

參考Gü l? in等[10]的方法。準確量取不同濃度的HPP樣液（50～500μg/mL）0.5mL，依次加入10mmol/L硫酸銅溶液0.1mL、7.5mmol/L新銅試劑0.1mL，最后加入蒸餾水至總體積3mL，室溫下反應30min后于450nm波長處測定吸光值，以吸光值（A450nm）表示還原銅離子能力。

1.2.9 HPP螯合亞鐵離子能力測定

參考張博文等[11]的方法。向離心管中依次加入不同濃度的 HPP樣液（0.3～3mg/mL）1mL和0.05%的硫酸亞鐵溶液2mL，振蕩均勻后于37℃水浴30min，再加入0.1%的鄰菲羅啉0.5mL，混勻后于37℃水浴10min，然后5000r/min離心10min，取上清液于510nm波長處測定吸光值A1；蒸餾水代替HPP樣液，測定吸光值A0；蒸餾水代替鄰菲羅啉，測定吸光值A2。按照式（3）計算螯合率。

1.2.10 HPP抑制卵黃脂質過氧化能力測定

參考張爾賢等[12]的方法。用0.1mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）配制體積分數4%的卵黃懸液。量取0.2mL卵黃懸液于試管中，加入不同濃度的HPP樣液（0.1-1mg/mL）1mL、25mmol/L硫酸亞鐵溶液0.2mL，用PBS緩沖液補齊至2mL，混勻后37℃水浴振蕩15min，取出后加入1mL質量分數10%的三氯乙酸，7000r/min離心10min。取上清液2mL并加入1mL質量分數0.8%硫代巴比妥酸，加塞，沸水浴保持30min，冷卻后于532nm波長處測定吸光值A1，蒸餾水代替HPP樣液，測定吸光值A0；蒸餾水代替卵黃懸液，測定吸光值A2。按照式（3）計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 Sephadex LH-20純化效果分析

圖1 Sephadex LH-20分離到的組分1和組分2的紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of partⅠand partⅡHPP of Sephadex LH-20

對54管收集液逐一進行紫外掃描后發現，3-20管收集液的光譜峰型基本一致，將其合并得到組分1；21-54管收集液的光譜峰型基本一致，將其合并得到組分2。組分1和組分2的紫外光譜如圖1所示。由圖1可知，組分1和組分2的紫外光譜曲線差異明顯，組分1的吸收峰在240nm和300nm附近，組分2的吸收峰在240nm和280nm附近。組分1和組分2凍干后，按照式（2）計算純度。結果表明，組分1的純度30.01%，略低于初級純化物的純度，但組分 2的純度有了顯著的提高，達到了 95.86%。故選擇組分 2（High purity polyphenols，HPP）進行后續試驗。

2.2 HPP對DPPH自由基的清除作用

圖2 HPP、VC及BHT的清除DPPH自由基能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of HPP, VC and BHT

DPPH·是一種穩定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，當有供氫能力的抗氧化劑存在時，其單電子被結合而使其顏色減褪，顏色減褪的程度與抗氧化劑清除自由基的能力存在定量關系。圖2所示的是HPP樣液及陽性對照VC和BHT對DPPH自由基清除能力的測定結果。由圖2可以看出，BHT對DPPH自由基的清除作用很弱，在試驗濃度范圍內，清除率最高才達到20.34%；HPP和VC則對DPPH自由基表現出很強的清除作用，隨著樣液濃度的增加，清除率都明顯提高，當HPP和VC濃度分別達到50μg/mL和30μg/mL后，清除率趨于平緩，不在升高。相比而言，HPP（IC50=20.48μg/mL）的清除效果要低于VC（IC50=12.76μg/mL）。

2.3 HPP對ABTS自由基的清除作用

圖3 HPP、VC及BHT的清除ABTS自由基能力Fig.3 ABTS radical scavenging activity of HPP, VC and BHT

ABTS法，最早由Miller等人提出，用于測定生物樣品的抗氧化能力。目前，該法已廣泛應用于蔬菜、水果抗氧化活性的評價和天然抗氧化物質的篩選[13]。無色的 ABTS經活性氧氧化后能夠生成穩定的藍綠色陽離子自由基，即ABTS+·，當有供氫能力的抗氧化劑作用時，ABTS+·被還原成無色的ABTS。圖3所示的是HPP、VC和BHT對ABTS自由基清除能力的測定結果。結果表明，隨著濃度的增加，HPP、VC和BHT對ABTS自由基清除作用增強，呈現很好的量效關系。同等條件下，VC的清除效果最好（IC50=66.79μg/mL），HPP（IC50=86.59μg/mL）次之，BHT（IC50=146.11μg/mL）最弱。

2.4 HPP對羥自由基的清除作用

圖4 HPP、VC及BHT清除羥自由基能力Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of HPP, VC and BHT

羥自由基是活性氧中化學性質最活潑的自由基，他幾乎能與細胞中任何生物大分子發生反應，且反應速度極快，是對機體危害最大的自由基[14]。過氧化氫和亞鐵離子的混合體系能夠啟動 fenton反應，產生羥自由基，而水楊酸可以捕獲體系中的羥自由基并生成有顏色的物質，該物質在510nm波長處有最大吸收，當反應體系中加入具有清除羥自由基作用的樣品時，該吸光值降低，通過測定反應體系吸光值的變化可以確定樣品的清除作用。圖 4所示的是HPP、VC和BHT對羥自由基清除能力的測定結果。由圖可以看出，在濃度較低時，HPP對羥自由基的清除效果略微高于VC，但當濃度超過0.3mg/mL后，VC的清除能力明顯優于 HPP?？傮w來看，HPP對羥自由基的清除能力（IC50=0.45mg/mL）不如 VC（IC50=0.31mg/mL），但優于BHT（IC50=0.86mg/mL）。

2.5 HPP還原鐵離子能力

圖5 HPP、VC及BHT還原鐵離子能力Fig.5 Fe3+ reducing ability of HPP, VC and BHT

抗氧化劑能將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再與三價鐵作用，生成普魯士蘭，通過測定普魯士蘭的生成量即可確定樣品的還原力。還原力的測定,實質上是檢驗物質是否為良好的電子供應者的過程。圖5所示的是HPP、VC和BHT還原鐵離子能力的測定結果。結果表明，HPP有較好的還原鐵離子能力，吸光值隨著濃度的增加而增大，而且與同濃度下VC的還原能力相近，明顯高于BHT。

2.6 HPP還原銅離子能力

圖6 HPP、VC及BHT還原銅離子能力Fig.6 Cupric ion-reducing ability of HPP, VC and BHT

Cu2+在有抗氧化劑存在時，被還原成Cu+，后者能與新亞銅試劑生成黃色絡合物，該絡合物生成的量越多，說明抗氧化劑的還原能力越強。圖6所示的是HPP、VC和BHT還原銅離子能力的測定結果。由圖可以看出，在試驗濃度范圍內，BHT基本沒有還原銅離子的能力，而HPP卻展現了很好的還原效果，但其還原銅離子的能力還是要弱于VC。

2.7 HPP螯合亞鐵離子能力

圖7 HPP和EDTA-Na2螯合亞鐵離子能力Fig.7 Fe2+ chelating activity of HPP and EDTA-Na2

亞鐵離子能與鄰菲羅啉發生絡合反應，生成桔紅色絡合物，其顏色深淺與反應體系中游離的亞鐵離子含量成正相關。因此，反應體系的顏色越淺，說明游離的亞鐵離子越少，即樣品的鰲合能力越強。圖7所示的是HPP樣液及陽性對照EDTA-Na2螯合亞鐵離子的測定結果。結果表明，隨著濃度的增大，HPP螯合亞鐵離子的能力逐漸增強，展現了很好的量效關系，IC50=2.14mg/mL，但其作用效果不及陽性對照EDTA-Na2（IC50=0.67mg/mL）。在濃度1.2mg/mL時，HPP的鰲和率僅為24.75%，而EDTA-Na2的鰲合率已達到94.80%，隨著樣液濃度的繼續加大，HPP的鰲合率由32.59%增加到74.15%，而EDTA-Na2的鰲合率一直在99%左右。

2.8 HPP抑制卵黃脂質過氧化的能力

圖8 HPP、VC及BHT抑制卵黃脂質過氧化能力Fig.8 Inhibiting yelk peroxidation ability of HPP, VC and BHT

卵黃磷脂C-2位上所含極低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）中的不飽和脂肪酸（PUFA）在鐵離子催化下，經振蕩，能誘發過氧化，產生烷氧基（LO·）和烷過氧基（LOO·），再引發鏈式反應，加熱的條件下，過氧化產物可與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成紅色絡合物[15]。當有抗氧化劑存在時，鏈式反應被阻斷，紅色絡合物的生成量減少，通過測定其減少程度即可表征樣品抑制卵黃脂質過氧化的能力。圖8所示的是HPP樣液及陽性對照VC和BHT抑制卵黃脂質過氧化能力的測定結果。由圖8可以看出，HPP對卵黃脂質過氧化有很好的抑制作用，其作用效果（IC50=0.33mg/mL）優于VC（IC50=0.66mg/mL），但卻明顯不及BHT。BHT在濃度為0.3mg/mL時，抑制率達到了92.99%，此時HPP的抑制率為43.81%。

3 結論

采用SephadexLH-20分離純化紅松松球鱗片多酚提取物，獲得了純度90%以上的多酚樣品。但 SephadexLH-20只適合實驗室規模的應用。所以仍需要繼續探討紅松松球鱗片多酚提取物的純化方法，為實際生產應用提供參考。

HPP對DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的清除能力都優于BHT，但卻弱于VC其IC50分別為VC的1.61倍、1.30倍和1.45倍；HPP還原Fe3+和Cu2+的能力明顯強于BHT，其還原Fe3+能力與VC相似，還原Cu2+能力略低于VC；HPP鰲合Fe2+的能力不及EDTA-Na2，其IC50為EDTA-Na2的3.19倍；HPP抑制卵黃脂質過氧化的能力雖然不及BHT，但卻強于VC，其IC50為VC的0.5倍。

體外抗氧化試驗結果表明，HPP有很好的清除自由基能力和還原能力，能有效的抑制卵黃脂質過氧化，是一種具有開發潛力的天然抗氧化劑。

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