微乳的穩定性研究

張佩華，梅 子，傅玉穎，*

(1.浙江省質量檢測科學研究院，浙江杭州310013;2.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310035)

微乳，能通過表面活性分子，將兩種互不相容相制備成熱力學穩定，各向同性的均一透明的納米級分散體系［1］。作為一種優良的載體，它能有效提高非水溶性物質在水中的溶解度，保護增溶于其中的活性物質(β－胡蘿卜素，抗壞血酸VE等)抵抗外界環境破壞及一系列降解反應(氧化、消化、酶解等)［2－4］，常在食品、化妝品及醫藥中增溶運載非水溶性活性物質［5－7］。將單辛酸甘油酯作為油相制備出食品級O/W型微乳可有效改善單辛酸甘油酯在水中的溶解狀況。但相對于其他行業，食品微乳化技術挑戰性較高，出于安全角度考慮，能應用于食品的表面活性劑種類、用量極為有限。且食品加工過程中，水相稀釋及各種成分添加往往會破壞微乳結構，引起微乳相變。在食品行業中，擁有水稀釋能力的溶膠才具有實踐價值［8］，而目前缺乏具有稀釋穩定性的微乳濃縮液［9］。本實驗，通過粒徑分析，渾濁度測定，Zeta電位比較，離心及穩定性實驗，繼續深入探討稀釋，鹽離子濃度，酸堿性，溫度對單辛酸甘油酯微乳穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單辛酸甘油酯(GMC)食品級，河南正通化工有限公司;吐溫80 食品級，廣州匯科精細化工有限公司;無水乙醇、丙二醇(PG)、磷酸氫二鈉、氯化鈉天津市永大化學試劑有限公司;檸檬酸 天津市光復科技發展有限公司;雙蒸水 實驗室自制;上述試劑無特殊說明外皆為分析純。

粒度、Zeta電位分析儀(Zatasizer Nano ZS) 英國馬爾文公司;紫外分光光度計(UV－3200PC) 上海美譜達;電導率儀(DDSJ－308A) 上海精科;離心機(TGL－16M) 湖南湘儀;超聲波清洗器(KQ100－DE) 昆山市超聲儀器有限公司;分析天平(AR2140)美國奧豪斯儀器有限公司;pH計(PHS－3C)上海理達儀器廠;自動雙重純水蒸餾器(SZ－93)上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 微乳制備 經過篩選實驗，確定油相:單辛酸甘油酯(GMC)與丙二醇(PG)質量比2∶1，表面活性劑相:吐溫80與乙醇質量比2∶1，擬三元相圖見圖1。固定油相與表面活性劑相質量比7∶3混合均勻，稱取一定質量的微乳原液于具塞比色管中，分別用5倍，10倍，100倍質量的水相稀釋，制備出 T73－5，T73－10，T73－100微乳，同樣方法制備油相與表面活性劑相質量比8∶2 的微乳 T82－5，T82－10，T82－100(配方比例見表1)。每支比色管上下顛倒10次，超聲30min，25℃平衡24 h。

圖1 單辛酸甘油酯擬三元相圖Fig.1 Phase diagram of the GMC microemulsion system

表1 微乳各組分質量分數Table 1 GMC，Tween80 and Water calculated concentration in different microemulsion systems

1.2.2 電導率測定 將油相、表面活性劑相按一定質量比配制的微乳原液于試管中，恒溫在(25±1)℃下，逐漸滴加水相，攪拌均勻，測定電導率隨含水量的變化。

1.2.3 pH測定 參照2.2電導率測定方法測定pH隨含水量的變化值。

1.2.4 增溶特性 Wm［10］，某一稀釋線上水相的最大添加量。

1.2.5 穩定性實驗

1.2.5.1 粒度分析 采用Zatasizer Nano ZS粒度分析儀，測定前各試管微乳上下顛倒10次以混勻，記錄微乳的平均粒徑及粒徑分布圖。平行3次，測定溫度與微乳貯放溫度對應，粒徑分布圖為平衡7d時的微乳粒徑分布。

1.2.5.2 渾濁度測定 用分光光度法測量吸光度，表征微乳的渾濁度。

吸收波長的選擇:

對在25℃下靜置24h后的T82－100、T73－100 微乳進行350～800nm全波段掃描，選取適當的波長，作為渾濁度比較的入射光波長。

吸光度(Abs)測定:

在適當的波長下，測量微乳的吸光度，體系越渾濁，吸光度越大。

1.2.5.3 Zeta電位測定 選用Zeta電位尺寸測量范圍為3.8nm～100μm的馬爾文Zatasizer Nano ZS分析儀，樣品測試前平衡24h，25℃下測量，每個樣品掃描6次，2次平行。

1.2.5.4 離心實驗 3000r/min，離心5min［11］觀察微乳沉淀、分層及油水相分離情況。

1.2.5.5 貯藏實驗 25℃及測試溫度下存放1個月，定期觀察乳液渾濁、分層及沉淀情況。

2 結果與分析

2.1 渾濁度測量方法確定

分光光度法可用來測量水質、懸濁液、飲料等的濁度，當乳液中當粒子直徑遠大于入射光光波長(D?λ)時，主要發生光的反射，也有可能發生光的折射或吸收，體系呈渾濁狀;當粒子直徑遠小于入射光光波長(D?λ)時，光完全透過，體系呈澄清透明狀態;當粒子直徑與入射光光波長相差不大時，則光有散射現象，體系呈半透明狀［12］。

圖2 微乳體系全波段掃描Fig.2 All band ultraviolet scanning for microemulsion systems

T73－100，T82－100 在入射光光波長 350～800nm無特征吸收峰，微乳液的質點一般在10～100nm，遠小于可見光的波長400～780nm，光能完全透過，且一般分光光度計在600nm處對渾濁度反應比較靈敏，并結合參照文獻［13］，選取600nm為吸光度測量時的入射光光波長。

2.2 稀釋對微乳的影響

2.2.1 相行為的變化 水分稀釋會引起微乳相行為的變化。圖1中白色部分為單相區(混合液透明或半透明)，黑色部分為多相區(混合液渾濁或分層)，各稀釋線上，最大水相增溶量Wm變化見表2。

隨著表面活性劑相比例的增加，稀釋線最大水增溶量也逐漸增大，當表面活性劑相與油相比為7∶3，8∶2和9∶1時，Wm達到100%，即此微乳有三條無限稀釋通道，T73、T82和T91，它們分別表示表面活性劑相的質量分數為70%，80%與90%，油相質量分數為 30%，20%與 10%［14］。

表2 微乳稀釋線水相增溶量變化Table 2 Water solubilization capacity，Wm，alone dilution lines

考慮到油的增溶及微乳稀釋穩定性，選擇T73，T82稀釋線作為研究對象。

T73與T82電導率變化趨勢相同，根據電導滲濾閾值理論，T73與T82的滲濾閾值均為13%。水含量小于13%時，形成的W/O型微乳外相不易導電，體系主要靠分散水滴碰撞電導，電導率增加緩慢。以T73為例，13% ＜W% ＜52%時，電導率呈直線上升，增加的水滴逐漸形成電導鏈，當水含量處于52%～68%時，初期由W/O型微乳液滴粘性碰撞產生的水相通道擴大并連接，形成網絡結構，體系處于油水局部連續的過度態中間結構，即雙連續相(B.C)，電導率增加減緩，68%水含量時電導達到最大，完成雙連續相向O/W型微乳的轉變，之后水分的稀釋使得電導率下降。T82微乳在水含量為47%時就開始由W/O型轉變為雙連續型，W% ＞66%時，完成雙連續型微乳向O/W型微乳的轉變。T82微乳雙連續型結構(B.C)形成范圍(47% ＜W% ＜66%)略大于T73微乳(52% ＜W% ＜68%)，這可能是表面活性劑比例的提高利于B.C型微乳的形成。

2.2.2 pH變化 水分含量＜10%之前，pH稍有增大，之后一直減小到趨于恒定。這可能是單辛酸甘油酯中含有少量雜質辛酸，在水分稀釋過程中，辛酸緩慢溶解使得pH一直下降到趨于固定值。

2.2.3 粒徑及渾濁度變化 通過比較不同含水量T73－5、T73－10、T73－100 和T82－5、T82－10、T82－100微乳的粒徑分布及貯藏過程中吸光值、平均粒徑變化，分析稀釋及組分對微乳穩定性的影響。

圖4 pH隨水含量的變化Fig.4 The influence of water on the pH of dilution lines T73 and T82

圖5描述的是不同稀釋梯度微乳的粒徑分布。T73－5微乳只有一個分布峰，集中在5～30nm之間，T73－10微乳粒徑主要分布在 6～25nm，在 100～1000nm處也有明顯分布，而 T73－100微乳在6～600nm之間都有分布，以6～50nm的粒徑為主，見圖5a;T82－5，T82－10，T82－100 微乳隨著水分含量的增加，粒徑分布沒有明顯變化，都集中在5～50nm之間，只有T82－100微乳有極少量大于100nm的微粒，見圖5b。圖6a測定的是用5、10、100倍質量水稀釋的T73微乳25℃下分別貯藏1、7、30d時的粒徑及吸光度。T73－5微乳粒徑幾乎無變化，T73－10、T73－100微乳隨著時間的推移，粒徑均增大，其中T73－10粒徑在7～30d之間變化明顯。不同水分含量的T82－5、T82－10、T82－100 微乳，在 1～30d 的貯藏期內，平均粒徑均＜15nm，吸光值維持在0.015以下。(圖6b)

圖5 各稀釋度下微乳粒徑分布圖Fig.5 The influence of water concentration on particle size distributions of different microemulsions

水分稀釋會減少了表面活性劑相對含量，使單體液滴上吸附的表面活性劑量不足，不能維持滿足超小尺寸納米顆粒的超低界面張力，單體液滴易于凝結。同時，稀釋可能會引起乙醇等助表面活性劑從微乳單體液滴界面分離出來，溶解到連續相中，動搖微乳微粒界面，最終破壞微乳微結構［15］，造成T73－10、T73－100 微乳產生較大粒徑;但 T73－100 微乳貯藏30d的平均粒徑小于T73－10，體系比T73－10澄清，呈半透明狀，T73－10卻變成了白色濁狀液體，這也許是稀釋拉開了微乳微粒之間的距離，減少了微粒碰撞聚合的幾率。

T82所有稀釋度的微乳都具有優良的稀釋穩定性。制備食品級微乳時，當油與表面活性劑結構兼容，再適當地添加多元醇(丙醇、甘油)與乙醇，可得到水或油全稀釋的微乳［16］單辛酸甘油酯與吐溫80都是雙親分子，親油基均為脂肪酸基，單辛酸甘油酯親水基呈線狀，吐溫80親水基呈環狀，他們具有良好的兼容性，當以合適比例混合時，再多的水分稀釋也不會引起微乳體系發生相變。

圖6 不同貯藏時間稀釋度對微乳粒徑及吸光度的影響Fig.6 Effect of water and storage time on the mean particle diameter and absorbance of microemulsions

2.3 Zeta電位的測定

Zeta電位測量的是粒子表面靜電荷和界面電壓分布，是粒子間靜電作用的一個重要參數，常用來表征膠體分散系的穩定性。一般把Zeta電位絕對值25～30mV作為分散系穩定的分界線，大于25～30mV的才具有穩定意義。本實驗制備的各稀釋度T73、T82微乳，隨著稀釋倍數的加大，Zeta電位絕對值也不同程度的相應增加，這可能是因為制備微乳的單辛酸甘油酯含有少量的辛酸雜質，隨著水分的添加，辛酸電離程度提高，導致體系中產生微量電荷。這些微乳體系的Zeta電位絕對值都小于20mV，低于25～30mV，但這并不能說明體系不穩定，從粒徑分析，渾濁度測定，貯藏實驗評價等角度考察，各稀釋度的T82微乳具有很好的穩定性。這可能是因為非離子表面活性劑制備的微乳體系中不帶電荷，穩定性主要依賴與超低界面張力。Zeta電位的測定對與評價非離子表面活性劑制備的乳劑穩定性價值不大［17］，不少文獻制備的穩定性微乳 Zeta 電位也不高［18－21］。

表3 各稀釋度微乳的Zeta電位Table 3 Zeta potential of different microemulsion systems

2.4 鹽離子濃度對微乳的影響

選擇T73－100與T82－100為研究對象，探討鹽離子濃度對微乳穩定性的影響。

以0.1、0.2、0.3、0.6mol/L 的 NaCl鹽溶液代替雙蒸水為水相，配制出不同鹽離子濃度的T73－100，T82－100微乳，放置于25℃下貯藏，觀察微乳表觀狀態，測定25℃下的粒徑及600nm下的吸光值。

一般而言，非離子表面活性劑配置的微乳，電解質能吸附與膠粒表面形成溶劑化層，使分散相與分散介質性質相同，減小兩粒子間的吸引力，穩定微乳，同時電解質的加入會爭奪體系中的水，引起表面活性劑“鹽析”，降低增溶能力，不利于微乳穩定。圖7a描述的是不同鹽離子濃度的T73－100微乳在25℃下貯藏7d的粒徑分布。0.1mol/L NaCl配制的微乳有兩個主要分布峰，7～60nm與80～800nm，與不加鹽離子的對照微乳及0.2mol/L下的微乳粒徑分布比較，20nm左右的微粒分布較多;0.3mol/L NaCl配置的微乳，粒徑在8～200nm之間都有分布，只有1個分布峰，但主要集中分布在20nm左右，當鹽離子濃度達到0.6mol/L時，粒徑分布增寬到8～400nm，且在100nm左右的微粒增多。貯藏30d時，各鹽離子濃度的T73－100微乳平均粒徑均有不同程度增加，其中0.1mol/L下的平均粒徑最小，0.6mol/L的最大，見圖8a。這些現象的發生可能是因為微量的鹽離子能在微乳粒表面形成溶劑化層，加大微乳之間排斥力，有利于微乳穩定，但當鹽離子過多時，會爭奪水分子，減少溶解表面活性劑的分散劑，促進微乳粒之間聚沉，隨著時間的推移，逐漸產生大顆粒。

鹽離子對 T82－100微乳影響較小。在0～0.6mol/L NaCl范圍內，T82－100微乳平均粒徑均小于20nm(圖7b)，粒徑分布于7～30nm之間(圖7b)，貯藏期30d內，平均粒徑無明顯變化(圖8b)，離心實驗無沉淀及分層現象，相對于T73－100來說，T82－100微乳具有良好的耐鹽性及貯藏穩定性。

2.5 pH對微乳的影響

0.1 mol/L檸檬酸與0.2mol/L磷酸氫二鈉配置成緩沖液代替雙蒸水為水相，制備出pH分別為3、5、7、8的T73－100，T82－100微乳，探討pH對微乳穩定性的影響。

不同 pH下，T73－100微乳的粒徑在 100～1000nm之間都有較多分布，且隨著pH的增大，此粒徑范圍內的微粒逐漸增多(圖10a)。一方面可能是檸檬酸與磷酸氫二鈉的添加，增加了體系中的電解質，改變了微乳微觀結構;另一方面，配置此微乳的表面活性劑(吐溫80)與油(單辛酸甘油酯)都屬于酯類，酯類在酸堿條件下會發生水解反應，特別在堿性溶液中，發生的皂化反應會不可逆得生成相應的醇與羧酸鹽。醇分散到水相中，單個表面活性劑的親水基團變為COO－，親水基團尺寸減小，親水性相對減弱，當水解達到一定量時，會使得表面活性劑之間距離增加，減小微乳微粒之間的排斥力，發生聚合。因此對比雙蒸水配置的T73－100對照微乳，各pH下的平均粒徑均有不同程度增大，pH8時增加幅度最大。pH3對微乳平均粒徑影響最小，這可能是因為H3O+的提供，加強了非離子表面活性劑聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫80)氧乙烯基團上的氧與醇分子中－OH基團結合，形成穩定的氫鍵，加強微乳液的液膜強度，有利于穩定［22］。

圖7 各鹽離子濃度下微乳粒徑分布圖Fig.7 The influence of NaCl concentration on particle size distributions of different microemulsions

圖8 不同貯藏時間鹽離子對微乳粒徑及吸光值的影響Fig.8 Effect of storage time on mean particle diameter and absorbance of microemulsions prepared with different concentrations of aqueous NaCl

圖9 各pH下微乳粒徑分布圖Fig.9 The influence of pH on particle size distributions of different microemulsions

在不同pH下，T82－100微乳均集中分布在5～50nm之間(圖9b)，且在30d貯藏期內，平均粒徑及渾濁度變化不明顯(圖10b)。T82－100在pH3～8范圍內，具有較高的穩定性。

2.6 溫度對微乳的影響

選擇0、25、40℃，3個溫度梯度為變化因素，將配制好的T73－100，T82－100微乳貯藏在對應溫度下，觀察表觀性狀變化，并定期測定相應溫度下的粒徑及吸光值。

圖11a，各溫度下T73－100微乳粒徑分布中發現，0℃時，微乳粒徑大部分分布在＞100nm，尤其＞1000nm的微粒數量比對照組(25℃)增多明顯，微乳貯藏30d后有白色沉淀產生。這可能是因為低溫使布朗運動減弱，不利于分散，導致微粒聚沉;而40℃時，微乳顆粒平均粒徑增大，保持在100nm左右，外觀呈均一半透明，有淡藍色乳光。這可能是在低于吐溫80相轉變溫度65℃時，溫度的提高會減小界面張力，增加微粒之間的有效碰撞概率，導致粒徑變大。但此微乳在40℃下貯藏30d后，粒徑依舊分布在100nm左右，引起此現象的原因，及是否可逆，有待進一步研究。

圖10 不同貯藏時間pH對微乳粒徑及吸光值的影響Fig.10 Effect of storage time on mean particle diameter and absorbance of microemulsions prepared with different pH aqueous solution

圖11 各溫度下微乳粒徑分布圖Fig.11 The influence of temperature on particle size distributions of different microemulsions a.T73－100;b.T82－100。

溫度對T82－100微乳粒徑分布影響不大，均主要分布在5～30nm之間，0℃低溫導致粒徑＞100nm的微粒稍微增多，貯藏30d后的平均粒徑增大到34nm(圖12b)，表觀性狀及吸光值改變不明顯。但40℃下，T82－100微乳幾乎無變化，具有較好的穩定性。

圖12 不同貯藏時間溫度對微乳粒徑及吸光值的影響Fig.12 Effects of storage time on mean particle diameter and absorbance of microemulsions prepared under different temperature

3 結論

3.1 該微乳在300～600nm范圍內分光光度計全波段掃描，沒有吸收峰。選擇T73與T82稀釋線為研究對象，通過電導率測定，確定了T73及T82微乳的相行為變化及不同結構微乳的相區域，發現表面活性劑比例的提高能擴大B.C型微乳形成范圍。

3.2 用5、10、100倍質量雙蒸水稀釋T73及T82微乳的研究中表明，稀釋是導致微乳不穩定性的重要因素之一，隨著水分添加，T73微乳平均粒徑增大，且貯藏不穩定，而各稀釋度的T82微乳具有優良的穩定性，在30d的貯藏期內，平均粒徑、吸光度都很小。通過比較微乳的Zeta電位，發現Zeta電位并不適合于評價非離子表面活性劑制備的微乳穩定性。

3.3 鹽離子對非離子表面活性劑制備的微乳影響較小，少量的鹽離子有利于微乳的穩定，較高濃度時會導致大粒徑微粒增多。

3.4 pH會引起微乳粒徑向右分布，尤其是堿性條件，當pH為8時，T73－100微乳粒徑在＞100nm有較多分布，表觀性狀也明顯發生變化。

3.5 選擇0、25、40℃探討溫度對微乳穩定性的影響發現，0、40℃會影響T73－100 微乳的穩定性，40℃下貯藏7d，T73－100微乳呈良好的均一半透明狀且具有乳光現象，粒徑均勻分布在100nm左右，30d后，此現象依舊，粒徑分布變化不大。

3.6 本實驗制備的 T82－100微乳，在 NaCl濃度0.1～0.6mol/L，pH3～8，溫度 0～40℃ 之間，吸光值＜0.015。

［1］Leung R，Shah D O.Solubilization and phase equilibria of water－in－oil microemulsions I.effects of spontaneous curvature and elasticity of interfacial films［J］.Journal of Colloid and Interface Science，1987，120(2):320－329.

［2］Chiu Y C，Yang W L.Preparation of vitaminE microemulsion possessing high resistance to oxidation in air［J］.Colloids and Surfaces，1992，63(3－4):311－322.

［3］Flanagan J，Singh H.Microemulsions:a potential delivery system for bioactives in food［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2006，46(3):221－237.

［4］Gaonkar A G，Bagwe R P.Microemulsions in food:challenges and applications［J］.Surfactant Science series，2003，109:407－430.

［5］Moreno M A，Frutos P，Ballesteros M P，et al.Release of nortriptyline hydrochloride from oil－ water microemulsions［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2000，48(11):1623－1627.

［6］Ktistis G，Niopas I.A study on the In－vitro percutaneous absorption of propranolol from disperse systems［J］.Jouranl of Pharmacy and Pharmacology，1998，50(4):413－418.

［7］Trotta M，Gallarate M，Pattarino F，et al.Investigation of the phase behaviour of systems containing lecithin and 2－acyl lysolecithin derivatives［J］ .International Journal of Pharmacentics，1999，190(1):83－89.

［8］黃芬，唐年初，郭貫新，等.食品級大豆油W/O型微乳的制備研究［J］.2010，31(2):280－285.

［9］Spernath A，Aserin A，Garti N.Fully dilutable microemulsions embedded with phospholipids and stabilized by short－chain organic acids and polyols［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2006，299(2):900－909.

［10］姚靜，周建平，平其能，等.輔助表面活性劑對微乳相行為的影響［J］.中國現代應用藥學雜志，2008，25(1):39－43.

［11］崔正剛，殷福珊.微乳化技術及應用［M］.北京:中國輕工業出版社，1999，81－81.

［12］方元超.飲料乳濁液及其濁度的分光光度法測量［J］.中國食品添加劑，2003，(4):112－113.

［13］Ruckenstein E，Chi JC.Stability of microemulsions［J］.Journalofthe ChemicalSociety，Faraday Transactions2:Molecular and Chemical Physics，1975，71:1690－1707.

［14］Garti N，Spernath A，Aserin A，et al.Nano－ sized selfassemblies of nonionic surfactants as solubilization reservoirs and microreactors for food systems［J］.Soft Matter，2005，(3):206－218.

［15］豐雋莉，王正武，俞惠新，等.VE的微乳化研究［J］.食品與機械，2006，22(5):36－39.

［16］Rao J J，McClements D J.Food － grade microemulsions，nanoemulsions and emulsions:fabrication from sucrose monopalmitate ＆ lemon oil［J］.Food Hydrocolloids，2011，25(6):1413－1423.

［17］陳立亞，于寶珠，趙慧芳.Zeta電位及其在藥學分散體系研究中的應用［J］.藥物分析雜志，2006，26(2):281－285.

［18］王玉強.槲皮素微乳的研究［D］.濟南:山東大學藥劑學，2006.

［19］吳雪梅.姜黃素新劑型:自乳化和亞微乳給藥系統的研究［D］.福建:福建醫科大學藥理學，2010.

［20］艾立，劉明星，劉清飛，等.巖黃連生物堿自微乳的制備及體外評價［J］.中國藥學雜志，2008，43(21):1633－1637.

［21］沈海蓉，李中東，鐘明康.阿托伐他汀自微乳釋藥系統的制備和評價［J］.藥學學報，2005，40(11):982－987.

［22］孫華.氰戊菊酯微乳液形成過程的研究［D］.泰安:山東農業大學農藥學，2005:35－36.