粘質沙雷氏菌的分離鑒定及產紅色素培養基的優化

季秀玲，林連兵，張 琦，魏云林

（昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500）

很多天然色素安全可靠、沒有毒副作用，色調自然，接近天然物質，其中很多品種均具有生理活性，如β-胡蘿卜素在抗癌、預防心血管疾病及白內障上有顯著功能，因此開發天然色素是國際上研究的重點。

靈菌紅素是具有三個吡咯環骨架結構的天然紅色素，具有抗細菌、真菌、瘧疾和霉菌、抗病毒、免疫抑制和抗腫瘤等作用[1-4]。作為一種新的天然抗癌待選藥物，靈菌紅素已逐漸成為國內外癌研究的熱點之一[5-7]；而微生物發酵生產的靈菌紅素更是比較理想的天然色素，因此該色素具有很好的應用前景。隨著現代生物技術的迅速發展和對靈菌紅素的深入研究，靈菌紅素的產生和作用機制將會被更加清晰地認識，大量制備，并應用于免疫治療以造福于人類。

本文從昆明冶煉廠廢水中篩選得到一株產紅色素的KMR-3菌株，對其形態特征、生理生化鑒定以及基于16S rRNA序列的系統發育分析進行了研究，并以KMR-3為出發菌株，對其產紅色素的培養基進行了優化，通過全波長掃描，初步確定紅色素為靈菌紅素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白胨、酵母膏、NaCl 分析純，天津化學試劑三廠；pMD18-T載體、T4 DNA連接酶（經SDS-PAGE考馬斯亮藍染色檢測其純度大于95%） TaKaRa大連寶生物。

PCR擴增儀 杭州博日科技有限公司；UV1700紫外分光光度計 日本島津公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；ZWY-1102恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Gel Doc XR凝膠成像系統 美國BIORAD公司；Sigma 1-14離心機 德國Sigma公司；細菌生化微量鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 KMR-3菌株的分離 采集云南省昆明冶煉廠周圍的廢水，水溫15℃，pH5.0左右。將采集到的樣品經濾紙過濾，取2mL濾液于100mL LB液體培養基中進行富集培養，15℃，150r/min培養24h。吸取10μL富集培養的混合菌液，稀釋10倍、100倍、1000倍涂布LB平板（Φ＝9cm）：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L。15℃，150r/min培養24h，然后挑取不同單菌落于LB平板上劃線分離純化，獲得單菌落。

1.2.2 生理生化特性

1.2.2.1 KMR-3菌落及菌體形態的觀察 吸取20μL新鮮培養的KMR-3菌液，稀釋不同倍數，涂布于LB固體平板上，15℃培養2d，觀察KMR-3菌株菌落形態；革蘭氏染色觀察KMR-3菌體形態。

1.2.2.2 生長溫度對KMR-3菌株產紅色素影響 涂布10μL新鮮培養的KMR-3菌液于LB固體平板上，分別置于4、15、28、37、42℃培養，觀察細菌生長狀況及溫度對色素產生的影響。

1.2.2.3 生長pH對KMR-3菌株產紅色素的影響 接種10μL新鮮培養的KMR-3菌液于不同pH（1～14）的5mL LB液體培養基中，28℃，150r/min，培養24h，觀察菌體生長pH范圍。

1.2.2.4 生理生化特征鑒定[8]KMR-3菌株于28℃，150r/min，培養12h，取5μL新鮮培養液接種于細菌生化微量鑒定管內，28℃培養24h，觀察結果。鑒定項目有：糖醇類的氧化發酵實驗（包括葡萄糖、乳糖、山梨醇、衛矛醇）、H2S產生實驗、賴氨酸脫羧酶實驗、鳥氨酸脫羧酶實驗、苯丙氨酸脫氨酶實驗、尿素實驗、丙二酸鹽實驗、側金盞花醇實驗、葡萄糖磷酸鹽胨水實驗、西蒙氏枸櫞酸鹽實驗。

1.2.3 分子生物學分類鑒定 利用16S rRNA基因的一對通用引物進行PCR擴增，引物序列為：f15′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，r25′-ACGGCTACC TTGTTACGACTT-3′。PCR擴增程序：94℃變性30s，50℃退火1min，72℃延伸90s，30個循環；72℃延伸10min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠檢測后，與pMD18-T載體連接，電轉化感受態細胞E.coli DH5α，涂布含有氨芐青霉素（Amp）的LB平板，置于37℃培養12h。通過T載體的通用引物M13（RV/M4）檢測轉化產物。PCR擴增驗證的產物由北京三博遠志公司測序部進行雙向測序，序列提交GenBank，通過Blast進行序列同源性檢索分析。利用MEGA 4.1軟件構建系統發育樹，確定KMR-3菌株的分類學地位。

1.2.4 紅色素全波長掃描 將制得的色素樣品溶解在酸性甲醇溶液中，在200～700nm范圍內進行全波長掃描[9-10]。

1.2.5 色素產量的評定 KMR-3菌株發酵溫度為28℃，pH為5.0。對不同培養時間的發酵液取樣，通過離心取上清測定OD535值初步評估色素產量。

1.2.6 培養基成分的優化

1.2.6.1 不同培養基的確定 以LB液體培養基作為起始培養基，不同培養基的優化（不含胰蛋白胨、不含酵母粉和不含NaCl的LB改良培養基）見表1中的LB-1、LB-2和LB-3，分別于0、6、12、24、36、48、60、72和90h對發酵液取樣，離心取上清測定OD535值。

1.2.6.2 胰蛋白胨添加量的確定 以只含胰蛋白胨（5、10、15g/L）的液體培養基進行發酵，見表1中的LB-4、LB-5和LB-6，發酵液取樣時間同1.2.6.1，離心取上清測定OD535值。

1.2.6.3 甘油添加量的確定 以5g/L胰蛋白胨和0.5%、1%和2%甘油的液體培養基進行發酵，見表1中的LB-7、LB-8和LB-9，發酵液取樣時間同1.2.6.1，離心取上清測定OD535值。

表1 產紅色素培養基的組成Table 1 Compositions of media used for production of red pigment

2 結果與討論

2.1 KMR-3菌株的分離篩選

從冶煉廠周圍的廢水中分離到14株不同的細菌，其中KMR-3菌株能夠產生紅色素（圖1）。因此對該菌株進行形態學、生理生化特性及16S rRNA基因分析。

圖1 KMR-3菌株的菌落形態Fig.1 Colony morphological character of KMR-3 strain

2.2 KMR-3菌株的菌落及菌體形態

KMR-3菌株在LB平板上，15℃培養2d，菌落產生紅色素，菌落直徑約2mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑，較粘稠，易挑起（圖1），菌體革蘭氏染色為陰性、該菌菌體細胞為短桿狀，端圓。

2.3 生理生化特征

2.3.1 生長溫度對產紅色素影響 KMR-3菌株能在4、15、28、37℃培養條件下生長，在42℃不生長（表2）；4～28℃培養產生紅色色素，但37℃培養不產生色素，而把培養溫度從37℃降低到28℃培養又可產生紅色色素[11]，這與沙雷氏菌的特征很相近。而沙雷氏菌屬中有3個種可以產生靈菌紅素，分別為粘質沙雷氏菌、深紅沙雷氏菌和普城沙雷氏菌。因此還需通過其他的生理生化特征進行進一步地鑒定。

表2 不同溫度條件下KMR-3生長狀況及產色素情況Table 2 Growth and pigment of KMR-3 at different temperatures

2.3.2 生長pH對產紅色素影響 KMR-3菌株能在pH4～10范圍的LB液體培養基中生長，且均產生紅色素（表3），其中在pH5.0附近生長最快，初步認定為該菌的最適生長pH。

表3 KMR-3菌體生長pHTable 3 Growth of KMR-3 at various pH

2.3.3 菌株生理生化特征鑒定 KMR-3菌株能以葡萄糖、山梨醇、側金盞花醇、丙二酸鹽和西蒙氏枸櫞酸鹽作為唯一碳源生長，不能以乳糖和衛矛醇作為唯一碳源生長，不能利用尿素，不能產生H2S，賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和苯丙氨酸脫氨酶反應為陽性（表4）。因此，通過生理生化特征進一步表明，KMR-3菌株與已報道的粘質沙雷氏菌特性一致[12]，因此KMR-3菌株屬于粘質沙雷氏菌。

表4 KMR-3菌株生理生化特征Table 4 Physiological characteristics of KMR-3 strain

2.4 KMR-3菌株分子生物學鑒定

KMR-3菌株16S rRNA基因序列全長為1505bp，GenBank登錄號（Accession Number）為DQ629026.1。經NCBI Blastn分析，表明其與Serratia marcescens同源性最高，達99.9%，利用MEGA 4.1軟件構建了系統發育樹，如圖2所示。

圖2 KMR-3與相關菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain KMR-3 and its relatives

從系統進化樹可看出，KMR-3菌株與Serratia屬中的各菌株歸于同一簇群。因此，依據形態學和生理生化實驗的結果，將其鑒定為粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）的一個菌株。KMR-3在系統發育地位上屬于Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Enterobacteriales；Enterobacteriaceae；Serratia；Serratia marcescens。

2.5 紅色素全波長掃描

色素樣品在酸性條件下的最大吸收波長為535nm（圖3），與靈菌紅素的吸收波長一致，由此初步確定該色素為靈菌紅素[13-15]。

圖3 紅色素的全波長掃描圖譜Fig.3 Full wavelength scanning of red pigment

2.6 培養基成分的優化

2.6.1 不同培養基的確定 不同培養時間對發酵液取樣、離心取上清測定OD535值初步評估色素產量（圖4）。結果表明：發酵12h時，不含NaCl的LB-3培養基產色素能力較強，出現一個小的峰值；而發酵至48h時不含酵母粉的LB-2培養基產色素能力最強。因此采用不含酵母膏和NaCl即只含不同濃度胰蛋白胨的培養基（LB-4、LB-5和LB-6）進行發酵優化實驗。

圖4 不同培養基組分對色素產量影響Fig.4 Effect of different mediums on the yield of the red pigment

2.6.2 胰蛋白胨添加量的確定 不同培養時間對發酵液取樣、離心取上清測定OD535值初步評估色素產量（圖5）。結果表明：發酵36h時，與起始LB培養基相比，含5g/L胰蛋白胨的LB-4培養基產色素能力提高2倍，而10g/L和15g/L胰蛋白胨的LB-5和LB-6培養基產色素能力反而降低（圖5）。因此，以LB-4培養基進行發酵優化實驗。

圖5 不同蛋白胨含量對色素產量影響Fig.5 Effect of different tryptone content on the yield of the red pigment

2.6.3 甘油添加量的確定 針對粘質沙雷氏菌發酵產靈菌紅素培養基的配方的研究表明：對產色素來說，醇類物質如甘露糖、甘油、乙醇等是常用的碳源[16]。因此以甘油作為碳源優化了培養基。

不同時間對發酵液取樣、離心取上清測定OD535值評估色素產量（圖6），結果表明以5g/L胰蛋白胨和1%甘油的LB-8培養基產色素能力最強，是起始LB培養基的13.4倍。

目前對于粘質沙雷氏菌靈菌紅素的研究集中于高產菌種的獲得和生產工藝的優化方面，以提高該天然色素的產量，降低生產成本。例如Tao Jinli等通過補料分批發酵的方式提高靈菌紅素的產量[17]；Wei Yuhong等添加氨基酸的方式提高SS-1菌株靈菌紅素產量[18]；韋鳳等分離到一株Sm-128菌株，靈菌紅素粗品產量達到475mg/L[19]；郝名慧等分離獲得H31菌株并確定最優的碳源、氮源和無機鹽分別為蔗糖、牛肉膏和CaCl2，最終發酵液中靈菌紅素的OD535達到142.638[14]。本研究通過優化LB培養基組份及及含量，提高了KNR-3菌株產色素能力。

圖6 不同甘油濃度對色素產量影響Fig.6 Effect of different concentrations of glycerol on the yield of the red pigment

3 結論

從昆明冶煉廠廢水中篩選得到一株產紅色素的KMR-3菌株，經形態學、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析將其初步鑒定為粘質沙雷氏菌。通過優化LB液體培養基不同組分及含量，表明5g/L胰蛋白胨和1%甘油的液體培養基為最優培養基，其產色素能力是起始LB培養基的13.4倍。該培養基不僅具有安全性和蛋白用量少的特點，而且促進粘質沙雷氏菌快速產生大量紅色素，適用于現代生物工程中細菌次生代謝產物發酵、實驗室培養基和開發天然色素等領域。

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