羅漢果和熟地增加小鼠造血干細胞的數(shù)量和功能

白 琳，石桂英，楊亞軍，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

羅漢果和熟地增加小鼠造血干細胞的數(shù)量和功能

白 琳，石桂英，楊亞軍，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

目的 羅漢果和熟地具有增強機體免疫力，延年益壽的作用。本文研究羅漢果和熟地對造血干細胞的影響。方法 各組小鼠連續(xù)喂養(yǎng)羅漢果或熟地3個月，流式細胞儀測量小鼠的外周血、脾臟和骨髓中免疫細胞和造血干細胞的變化；小鼠用半致死劑量的放射線照射后，連續(xù)喂養(yǎng)羅漢果或熟地1個月后，流式細胞儀測量羅漢果或熟地對于免疫細胞和造血干細胞損傷修復(fù)的作用。結(jié)果 分析檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，長期喂養(yǎng)羅漢果或熟地的小鼠骨髓和外周血中B細胞的比例降低，粒細胞的比例增加，T細胞沒有明顯變化；骨髓中造血干細胞的數(shù)量增加，尤其是長期造血干細胞數(shù)量增加顯著。半致死劑量的放射線照射后，羅漢果或熟地喂養(yǎng)1個月，小鼠的粒細胞和T細胞都有明顯的改善，造血干細胞的數(shù)量明顯增加。結(jié)論 羅漢果或熟地長期服用會增加小鼠造血干細胞的數(shù)量和功能，促進了輻射所致的骨髓抑制小鼠的造血干細胞的恢復(fù)。

羅漢果；熟地；流式細胞術(shù)；造血干細胞

羅漢果為葫蘆科植物，具有清熱潤肺的功效，常年服用，能延年益壽，被人們譽為“神仙果”。研究表明，羅漢果皂苷提取物對I性糖尿病小鼠的免疫功能有重要調(diào)節(jié)作用，能顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬功能，增加免疫器官的重量，增強機體免疫功能［1］。熟地為玄參科植物地黃的塊根經(jīng)加工炮制而成。熟地具有補血滋陰的功效，研究表明，熟地具有補血和免疫調(diào)節(jié)作用。連續(xù)注射地黃6 d可促進小鼠造血干細胞的增殖［2-3］。羅漢果和熟地是中藥中延年益壽相關(guān)的中藥，但是其作用的細胞學(xué)依據(jù)還沒有明確的解釋。干細胞衰老是機體衰老的基礎(chǔ)，延年益壽相關(guān)的中藥對于干細胞的作用還沒有系統(tǒng)的研究。因此我們對小鼠長期喂養(yǎng)中藥研究其對造血干細胞的作用。

造血干細胞是一群處于靜息狀態(tài)的細胞，有迅速增殖、自我更新和分化的能力，確保了數(shù)十億壽命較短的外周血中的血細胞和免疫細胞不斷的更新。造血干細胞可以在不同的狀態(tài)下不斷切換休眠和激活的狀態(tài)［4］。放射線是誘導(dǎo)DNA損傷的重要手段，已被普遍應(yīng)用于研究骨髓造血干細胞損傷修復(fù)［5］。

長期服用羅漢果和熟地對于免疫細胞和骨髓造血干細胞的影響，以及損傷后對促進造血功能的恢復(fù)作用，目前尚未見文獻報道。因此，本文使用中藥羅漢果和熟地長期喂養(yǎng)小鼠，研究其對免疫系統(tǒng)和造血干細胞的影響。同時半致死劑量的放射線照射誘導(dǎo)造血干細胞損傷模型，研究羅漢果和熟地對造血干細胞損傷修復(fù)的作用。

1 材料和方法

1.1 動物

C57BL/6J雌性小鼠由本所繁育【SCXK（京）2009-007】。動物飼養(yǎng)在SPF動物房內(nèi)，實驗室中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準（批準號ILAS-SCAL-2012-003）。

1.2 中藥喂養(yǎng)

將小鼠隨機分為正常對照組、羅漢果喂養(yǎng)組和熟地喂養(yǎng)組。對照組小鼠給予常規(guī)的標準數(shù)量，羅漢果喂養(yǎng)組（200 mg/kg·d）和熟地喂養(yǎng)組（100 mg/kg·d））在常規(guī)的標準鼠糧中加入相應(yīng)劑量的藥物。藥物的劑量按照成人與小鼠之間藥物劑量換算系數(shù)換算。小鼠每天的攝入量為3 g/只/d。鼠糧和飲水保持新鮮，每3 d更換一次。

1.3 流式分析

外周血細胞取自小鼠眼眶，裂解紅細胞后，獲得外周血細胞懸液。小鼠脫頸椎處死后，取脾臟、后肢骨，置于冰上預(yù)冷的PBS中。脾臟用磨砂玻片研磨成細胞懸液；后肢骨用5mL注射器將骨髓細胞沖出，并吹打成細胞懸液。將細胞懸液用50μm尼龍濾膜過濾后收集到15 mL離心管中，用PBS定容至10 mL，混勻后計數(shù)，取106細胞標記熒光抗體。

骨髓造血干細胞的分析中用如下抗體進行標記：CD34-FITC、Flt3-PE、Sca1-PE-Cy7、cKit-APC、Gr-1-Biotin、Mac-1-Biotin、B220-Biotin、IL-7RBiotin、CD4-Biotin、CD8-Biotin、Biotin-APC-Cy7。骨髓造血干細胞（HSC）表面標記為：Lin-c-kit+sca1+，長期造血干細胞（LT-HSC）表面標記為：Linc-kit+Sca1+CD34-Flt3-，短期造血干細胞（STHSC）表面標記為：Lin-c-Kit+Sca1+CD34+Flt3-，多能祖細胞（MPP）表面標記為：Lin-c-Kit+Sca1+CD34-Flt3-。免疫細胞標記抗體：CD4-FITC、CD8-Pcrcp-cy5.5、B220-PE-Cy7、CD11B-APC-Cy7［6］。上述抗體加入細胞懸液，冰上避光，30 min；加1 mL染色緩沖液，離心，2600 r/min，5 min，棄上清，加200 μL染色緩沖液重懸細胞，用50μm尼龍濾膜過濾，冰上避光。使用美國 BD公司 Aria流式細胞儀檢測。

1.4 放射線照射

照射小鼠分為三組，每組10只，經(jīng)過60Co全身照射，劑量率0.5～1 Gy/min，總計量為4.5 Gy。照射后分別喂養(yǎng)正常飼料、熟地飼料和羅漢果飼料一個月，喂養(yǎng)劑量同上。一個月后取外周血、骨髓、脾臟進行相應(yīng)的實驗。

1.5 統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均采用x±s表示。組間資料分析采用t檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熟地和羅漢果對造血系統(tǒng)的影響

為了了解熟地和羅漢果對于造血系統(tǒng)的影響，我們將小鼠分為三組，分別為正常對照組，羅漢果喂養(yǎng)組和熟地喂養(yǎng)組。持續(xù)喂養(yǎng)3個月后，我們分別取小鼠的外周血、骨髓、脾臟組織的細胞通過流式細胞儀檢測其免疫細胞的比例。結(jié)果顯示與正常對照組相比，羅漢果和熟地喂養(yǎng)后在小鼠的外周血中B細胞（B220+）比例由（47.14±6.52）％降低到（32.86±9.02）％和（37.72±4.71）％，粒細胞（CD11b+）比例由（24.76±5.16）％上升為（30.32 ±6.88）％和（27.66±1.72）％（圖1A）；骨髓中B細胞比例由（10.91±2.78）％降低到（7.166± 1.08）％和（4.382±0.63）％，粒細胞比例由（20.96 ±3.86）％上升為（28.96±2.94）％和（28.96± 3.81）％（圖1B）；脾臟中B細胞和T細胞（CD3+）沒有明顯的變化（圖1C）。結(jié)果表明，長期喂養(yǎng)羅漢果和熟地對于小鼠免疫系統(tǒng)有著重要影響。

2.2 熟地和羅漢果對造血干細胞的影響

免疫細胞都是由造血干細胞發(fā)育而來，為了研究羅漢果和熟地對骨髓造血干細胞的影響，我們利用流式細胞儀分析了長期喂養(yǎng)羅漢果或熟地后造血干細胞的變化。結(jié)果顯示，與對照相比，喂養(yǎng)羅漢果或熟地后造血干細胞（LSK，Lin-Sca-1+c-kit+）的數(shù)量增加，喂養(yǎng)羅漢果后效果更加明顯（圖2B）。依據(jù)Flt-3和CD34可以將造血干細胞進一步劃分為長期造血干細胞（LT-HSCs，long-term HSCs，Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flt-3-）、短期造血干細胞（STHSCs，short-term HSCs，Lin-Sca-1+c-Kit+CD34+Flt-3-）和 多 能 干 細 胞 （MPPs， multipotent progenitors，Lin-Sca-1+c-Kit+Flt-3+）（圖2A）。結(jié)果顯示羅漢果和熟地對于長期造血干細胞數(shù)量的增加作用更加明顯，分別增加了2倍和1.2倍，短期造血干細胞和多能造血干細胞沒有明顯變化。因此，長期喂養(yǎng)羅漢果或熟地可以增加長期造血干細胞的數(shù)量，進而影響免疫細胞。

2.3 放射線照射后，熟地和羅漢果對造血系統(tǒng)的影響

骨髓是放射線敏感的器官，放射線照射后會造成免疫細胞的缺失，是研究骨髓造血干細胞損傷修復(fù)的重要方法。我們采用半致死劑量的放射線照射小鼠后，連續(xù)一個月喂養(yǎng)羅漢果和熟地，研究其對于免疫系統(tǒng)的恢復(fù)作用。實驗結(jié)果顯示，4.5 Gy照射后小鼠的外周血中T細胞和粒細胞與正常小鼠相比明顯降低，喂養(yǎng)羅漢果和熟地后，T細胞比例由（15.6±2.93）％ 恢復(fù)為（18.8±7.25）％ 和（25.99±7.65）％，粒細胞比例由（16.19±2.99）％上升為（16.19±6.18）％和（19.29±4.95）％，其中羅漢果的效果更加明顯（圖3A）。在骨髓中，B細胞數(shù)和粒細胞數(shù)都得到了恢復(fù)（圖3B）。但是在外周血中B細胞比例出現(xiàn)了明顯的降低，我們推測可能是由于喂養(yǎng)時間過長導(dǎo)致了B細胞發(fā)育產(chǎn)生障礙。結(jié)果說明，羅漢果和熟地可以調(diào)節(jié)小鼠放射線損傷后的T細胞和粒細胞的恢復(fù)。

2.4 放射線照射后，熟地和羅漢果對造血干細胞的影響

圖1 長期喂養(yǎng)羅漢果和熟地對免疫細胞的影響Note：A：percent of different cells in peripheral blood；B：percent of different cells in the bonemarrow；C：percent of different cells in spleen.Fig.1 Siraitia Grosvenoriand Rehmannia Glutinosa influence the cells of peripheral blood，bonemarrow and spleen

照射后，羅漢果和熟地會促進免疫細胞的恢復(fù)，為了了解其對造血干細胞的作用，我們利用流式細胞儀分析了造血干細胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，照射后造血干細胞的數(shù)量明顯降低，而喂養(yǎng)羅漢果和熟地后，造血干細胞數(shù)量明顯增加（圖4A）。將造血干細胞進一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過照射長期造血干細胞、短期造血干細胞和多能干細胞的細胞數(shù)分別降低了1.58倍、1.65倍和2.05倍，喂養(yǎng)羅漢果或熟地后數(shù)量都有很大程度的增加。長期造血干細胞數(shù)量增加了3.26倍和2.05倍；短期造血干細胞數(shù)量增加了2.1倍和1.82倍；多能干細胞數(shù)量增加了3.9倍和2.71倍。因此，羅漢果和熟地可以緩解射線造成的骨髓造血干細胞的抑制。

圖2 羅漢果和熟地影響造血干細胞的數(shù)量Note：A：Representative staining profiles for the HSCs and progenitor populations in BM.B and C：cell number of HSC and LT-HSC，ST-HSC，MPP.Fig.2 Siraitia Grosvenoriand Rehmannia Glutinosa influence the number of HSCs

圖3 4.5Gy照射后，羅漢果和熟地對小鼠免疫細胞比例的影響Note：A：percent of different cells in peripheral blood；B：percent of different cells in the bonemarrow.Fig.3 Siraitia Grosvenori and Rehmannia Glutinosa influence the cells of peripheral blood，bone marrow after 4.5Gy IR treatment

圖4 羅漢果和熟地促進4.5Gy放射線照射后造血干細胞的增殖Note：A and B：cell number of HSC and LT-HSC，ST-HSC，MPP after 4.5Gy IR treatment.Fig.4 Siraitia Grosvenori and Rehmannia Glutinosa recovered the number of HSCs after 4.5Gy IR treatment

3 討論

造血干細胞通過細胞分裂、自我更新、增殖和分化，一方面維持自身數(shù)量的穩(wěn)定，另一方面可以分化為各種功能細胞（粒細胞、單核巨噬細胞、紅細胞、巨核細胞/血小板、T/B細胞、NK細胞、樹突狀細胞等），最終維持血液系統(tǒng)的動態(tài)平衡［7］。在機體受到損傷后，造血干細胞會進入細胞周期，滿足整個機體對血細胞的需求［8］。

在中藥，熟地具有滋陰補血的作用，羅漢果能清肺潤腸，凈化血液中的過氧化物［9］。熟地中的地黃多糖可通過激活T淋巴細胞，促進T細胞增殖及分泌IL-2等途徑增強機體的免疫功能。地行多糖可以刺激骨髓粒系祖細胞和紅系祖細胞的增殖，增加外周血白細胞數(shù)［6］。羅漢果的皂苷提取物能使小鼠胸腺、脾臟等免疫器官增加，提高小鼠巨噬細胞的吞噬功能［1］。我們研究表明長期喂養(yǎng)小鼠熟地和羅漢果會促進造血干細胞的增殖，同時在機體受到損傷，喂養(yǎng)小鼠熟地和羅漢果可以促進造血系統(tǒng)的恢復(fù)。由于中藥成分的復(fù)雜性，熟地和羅漢果中的促進造血干細胞增殖的有效成分還不清楚，影響造血干細胞增殖的信號通路還需要繼續(xù)研究。

造血干細胞一方面可以維持機體內(nèi)血細胞和免疫細胞的動態(tài)平衡，另一方面在特定的環(huán)境下造血干細胞可以分化為其他組織細胞［10-12］。因此，造血干細胞在機體衰老中有著重要作用。羅漢果和熟地都具有延年益壽的作用，可能是通過促進造血干細胞的增殖和功能來延緩機體的衰老進程。

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Siraitia grosvenori and rehmannia glutinosa promote the hematopoietic stem cells and progenitor cells proliferation and function

BAILin，SHIGui-ying，YANG Ya-jun，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To investigate the influence of Siraitia Grosvenori and Rehmannia Glutinosa on the Hematopoietic stem cells proliferation and function.M ethods Cells from the peripheral blood，spleen and bonemarrow ofmicewere stained with indicated antibodies，and analyzed by flow cytometry.Mice were divided 3 groups：control group，Siraitia Grosvenori treatment group and Rehmannia Glutinosa treatment group.After 4.5Gy IR treatment，mice divided 4 groups：control group，4.5Gy IR treatment and feed with normal food，4.5Gy IR treatment and feed with Siraitia Grosvenori and 4.5Gy IR treatment and feed with Rehmannia Glutinosa for 1 month.Results Mice fed with Siraitia Grosvenori and Rehmannia Glutinosa decreased the percentage of B cells and increased the percentage of M cell.For HSCs，the number of HSCs was increased，especially the number of LT-HSCs.After 4.5Gy IR treatment，mice fed with Siraitia Grosvenori and Rehmannia Glutinosa increase the number of HSCs，and increased the percentage of M cells.Conclusion Siraitia Grosvenori and Rehmannia Glutinosa promote the hematopoietic stem cells and progenitor cells proliferation and function and recover the damage that caused by IR treatment.

Siraitia Grosvenor；Rehmannia Glutinsa；Flow cytometry；Hematopoietic stem cell

R332

A

1671-7856（2014）03-0050-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.011

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81200256）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金新教師類資助課題（20121106120034）。

白琳（1984-），女，助理研究員，博士。研究方向：干細胞與衰老。E-mail：bailin49@163.com。

張連峰，E-mail：Zhanglf@cnilas.org。

2014-01-07

研究報告