抑制小鼠乳腺腫瘤轉移microRNA的篩選

張 麗，李小穎，孫彩顯，張 旭，陳 煒，張連峰

（中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021）

抑制小鼠乳腺腫瘤轉移microRNA的篩選

張 麗，李小穎，孫彩顯，張 旭，陳 煒，張連峰

（中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021）

目的 鑒定25種microRNA的功能及其在乳腺癌中發(fā)揮的作用，以篩選新的抑制乳腺癌轉移的microRNA分子。方法 利用脂質體2000將25種鼠源microRNA表達載體轉染至4TO7細胞，經G418篩選結合流式細胞儀分選獲綠色熒光細胞得穩(wěn)定表達鼠源microRNA的細胞株。將細胞2×105個/只尾靜脈注射接種于BALB/C小鼠，14 d后解剖分離肺組織，統(tǒng)計小鼠肺組織結節(jié)數目。結果 和接種陰性對照細胞小鼠相比，接種mir-449a穩(wěn)轉細胞的小鼠腫瘤肺轉移減少。而接種 mir-1935穩(wěn)轉細胞的小鼠腫瘤肺轉移增多。其它23種microRNA穩(wěn)轉細胞接種小鼠腫瘤肺轉移既不增加也不減少。結論 從25種鼠源microRNA中篩選到2種與乳腺癌腫瘤轉移相關的microRNA：mir-449a抑制乳腺癌細胞肺轉移，mir-1935則促進癌細胞肺轉移。

4TO7；乳腺癌；小RNA；轉移；尾靜脈注射

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計數據，美國每年有23萬乳腺癌新發(fā)病例，2012年死亡人數為4萬。我國屬女性乳腺癌的低發(fā)國，但近年來乳腺癌的發(fā)病率明顯增高，躍居女性惡性腫瘤中的第一位，明顯高于其它癌癥的發(fā)病率。并以每年2％～3％的增長速率遞增，嚴重危害女性的生命和健康。

乳腺癌患者50％經手術治療后可治愈，50％患者在治療后5年內出現復發(fā)轉移，其中30％左右發(fā)生轉移導致死亡，乳腺癌轉移是導致患者死亡的主因。乳腺癌轉移好發(fā)的部位依次是肺、骨和腦等。轉移的惡性腫瘤往往對于傳統(tǒng)的腫瘤療法具有耐受性，且在臨床上不可治愈，因此迫切需要深入研究參與腫瘤轉移的內在的分子機制。

microRNA（miRNA）是一類長約19-23nt的單鏈非編碼RNA，miRNA與其靶mRNA的3’-UTRs（3’非編碼區(qū)）特異性結合，引起靶mRNA的翻譯抑制或切割降解。miRNA直接作用于約30％的人類基因，而且?guī)缀鯀⑴c所有的生物過程，包括細胞生長、細胞周期調控、細胞凋亡、分化以及應激反應等。在過去的五年里，一系列參與調節(jié)腫瘤轉移尤其是乳腺癌轉移調節(jié)的miRNA被發(fā)現，如miR-10b［1］，miR-335［2］，miR-373和 miR-520［3］。此外，miR-200和let-7家族也參與腫瘤的轉移調節(jié)［4-6］。研究發(fā)現，在乳腺癌細胞發(fā)展具備轉移特性時，一系列的miRNAs的表達丟失，如 miR-335，miR-206，miR-126［2］，miR-31［7］，miR-340［8］等，而恢復其表達則抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，反之則會促進轉移。

迄今為止，盡管多種miRNA的癌基因功能以及抑制腫瘤作用已經被闡明，但是腫瘤轉移相關的基因和miRNA之間錯綜復雜的相互作用關系還沒有真正清楚，而且目前miRNA靶點治療還沒有獲得成功［9］。因此，通過誘導miRNA分子在腫瘤細胞中的表達，可以尋找新的抗腫瘤細胞生長和遷移的miRNA分子靶點，發(fā)現更多與乳腺癌腫瘤轉移相關miRNA，從而為乳腺癌的治療提供新的思路。

我室購買了500種miRNA前體表達質粒庫，因此可以進行大規(guī)模的乳腺癌腫瘤轉移相關miRNA篩選。目前，我們已經通過向小鼠乳腺癌4TO7細胞轉染miRNA表達載體的方法，獲得50種穩(wěn)定表達miRNA的乳腺腫瘤細胞克隆，并比較了其中25種miRNA過表達對尾靜脈移植瘤生長的抑制或促進作用，初步篩選得到一種腫瘤轉移抑制miRNA和一種腫瘤轉移促進miRNA，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 鼠源m iRNA表達載體構建及質粒制備

鼠源 miRNA表達載體庫購自傲銳東源（OriGene Technologies），25條miRNA前體名稱及功能見表1（序列參見miRBase）攜帶SgfI和 MluI酶切位點，被克隆到pCMV-MIR載體的CMV啟動子下游。miRNA前體序列長度約600 bp，包含60-70 nt的pre-miRNA且攜帶上下游250-300 nt的側翼序列。經測序并比對正確無突變堿基后，質粒小提，醋酸鈉無水乙醇沉淀，質粒終濃度達1μg/μL以上，用于細胞轉染實驗。

1.2 細胞培養(yǎng)

小鼠乳腺癌細胞4TO7由實驗室凍存，用含10％胎牛血清（PAA）、100 IU/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的 DMEM（GIBCO公司）培養(yǎng)基作為4TO7細胞的培養(yǎng)液，于5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。

采用脂質體2000（Invitrogen公司）轉染4TO7細胞（具體轉染步驟參照脂質體2000操作說明）。轉染后24 h，1∶10傳代，用含 500μg/mL G418 （AMRESCO公司）的培養(yǎng)液篩選細胞2周，倒置顯微鏡（Nikon TS100）下挑選綠色熒光克隆進行擴大培養(yǎng)，流式細胞儀分選綠色熒光標記穩(wěn)定表達MicroRNAs細胞，并擴大培養(yǎng)。

1.3 實驗動物

BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司SCXK（京）2007-0001，雌性，體重18～20 g，在本實驗室無特定病原體（specific-pathogen free，SPF）的飼養(yǎng)間（SYXK（京）2009-0003）飼養(yǎng)。所有實驗操作程序均經過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準（批準號為ILAS-GC-2012-001）。

1.4 尾靜脈注射接種BALB/c小鼠

取對數生長期的轉染空載體的4TO7細胞及穩(wěn)定表達miRNA的4TO7細胞，分別調整細胞濃度至2×106cells/mL。每只 BALB/c小鼠尾靜脈接種0.1 mL單細胞懸液。小鼠模型分兩組，每組3～6只。陰性對照組，轉染pCMV-MIR空載體；陽性組，轉染miRNA表達載體。

1.5 觀察尾靜脈移植瘤生長情況

接種14 d后犧牲動物，解剖分離肺組織，觀察腫瘤的生長及轉移情況，計數并進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 25種m iRNA表達載體的構建

25條鼠源miRNA前體（表1）攜帶SgfI和MluI酶切位點，被克隆到pCMV-MIR載體的CMV啟動子下游（圖1），在轉染過程中，細胞內將以CMV啟動子驅動miRNA前體表達為成熟miRNA，發(fā)揮其相應的細胞學功能性。這些miRNA前體根據其功能及與腫瘤的關系密切程度可以分為三類：已經被實驗驗證與癌癥關系密切的7種miRNA分子如mir-133a-1、mir-148a、mir-24-2、mir-375、mir-376、mir-421、mir-449a；與癌癥關系未知的12種miRNA分子如mir-1-2-as、mir-466d、mir-467e、mir-487b、mir-546、mir-568、mir-654、mir-668、mir-682、mir-692-2、mir-763、mir-764等；還有最近新發(fā)現的6種miRNA分子包括mir-1193、mir-1895、mir-1902、mir-1931、mir-1935、mir-1940等。

2.2 25種m iRNA的穩(wěn)定轉染細胞系的建立

經過轉染，G418篩選結合流式細胞儀分選獲得表達25種miRNA的混合細胞克隆，經過多次傳代熒光強度穩(wěn)定，miRNA穩(wěn)轉細胞的形態(tài)、生長方式、生長速度等與轉染對照質粒的細胞無明顯差異。將細胞擴大培養(yǎng)用于BALB/c小鼠尾靜脈注射。其對照細胞及三類 miRNA的穩(wěn)轉細胞系（彩插5圖2）。

圖1 miRNA表達載體的構建

表1 25種鼠源microRNAs及涉及腫瘤Tab.1 25 mousemicroRNAs and related cancer

2.3 m iRNA過表達對乳腺癌細胞系尾靜脈移植瘤生長的調節(jié)

2.3.1 23種miRNA過表達對乳腺癌細胞肺轉移無明顯的抑制或者促進作用

將對數生長期的穩(wěn)定表達miRNA的4TO7細胞和穩(wěn)定表達對照載體的4TO7細胞分別對BALB/c小鼠進行尾靜脈接種。14 d后，脫頸處死，解剖取材，統(tǒng)計肺部腫瘤結節(jié)數目。結果發(fā)現，和對照組相比，陽性組的小鼠肺組織結節(jié)數目沒有明顯的增加或者減少，因此這些miRNA過表達對腫瘤細胞的肺轉移無明顯的抑制或者促進作用（圖3）。

圖3 23種miRNA對乳腺癌肺轉移無明顯的抑制或者促進作用Note：A-X were 4To7（n=6）、mir-1193（n=3）、mir1-2-as（n=5）、mir-133a-1（n=3）、mir-148a（n=6）、mir-1895（n=4）、mir-1902 （n=3）、mir-1931（n=6）、mir-1940（n=6）、mir-24-2（n=6）、mir-375（n=6）、mir-376a（n=6）、mir-421（n=5）、mir-466d（n=5）、mir-467e（n=6）、mir-487b（n=6）、mir-546（n=6）、mir-568（n= 3）、mir-654（n=6）、mir-668（n=3）、mir-682（n=6）、mir-692-2（n =6）、mir-763（n=3）and mir-764（n=6）.Fig.3 Twenty-threemicroRNAs neither inhibited nor promoted lungmetastases of breast cancer

2.3.2 mir-449a抑制尾靜脈移植瘤生長

將對數生長期的轉染陰性對照載體的4TO7細胞和穩(wěn)定表達mir-449a的4TO7細胞分別對BALB/c小鼠進行尾靜脈接種。14 d后，脫頸處死，解剖取材，統(tǒng)計肺部腫瘤結節(jié)數目。結果發(fā)現，和對照組相比，陽性組即接種表達mir-449a的乳腺腫瘤細胞的小鼠肺組織結節(jié)數目顯著減少，轉移程度降低（圖4）。

圖4 mir-449a過表達抑制腫瘤轉移Note：A，Tail vein xenografted tumors of control cells and cells expressing mir-449a； B，The number of metastasis foci in the lungs from mice inoculated with mir-449a-expressing 4To7 cells via tail vein was significantly decreased compared with mice inoculated with negative control cells.Fig.4 mir-449a over-expression inhibited tumor cellmetastasis

2.3.3 miR1935促進尾靜脈移植瘤生長

將對數生長期的穩(wěn)定表達miR-1935的4TO7細胞和穩(wěn)定表達陰性對照載體的4TO7細胞分別對BALB/c小鼠進行尾靜脈接種。14 d后，脫頸處死，解剖取材，統(tǒng)計肺部腫瘤結節(jié)數目。結果發(fā)現，和對照組相比，陽性組即接種表達mir-1935的乳腺腫瘤細胞的小鼠肺組織結節(jié)數目顯著增多，轉移程度增加（圖5）。

3 討論

腫瘤轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特性之一，腫瘤轉移機制及抗腫瘤的實驗研究不可能完全利用人體活檢和尸檢材料去完成，必須建立相應的動物及人類腫瘤動物轉移模型，特別是小鼠模型，這對研究腫瘤的轉移機制是極其重要的工具和手段。腫瘤轉移動物模型按轉移途徑可分為血道腫瘤轉移動物模型和淋巴道腫瘤轉移動物模型。按轉移程度還可分為高轉移腫瘤轉移動物模型（轉移率超過70％）和低轉移腫瘤轉移動物模型（轉移率低于30％）。李小穎等［21］對三株熒光素酶標記的小鼠乳腺癌細胞在小鼠體內生長及轉移進行比較，研究發(fā)現來源于BALB/cfC3H小鼠自發(fā)乳腺癌細胞株的4TO7細胞轉移能力中等，尾靜脈注射14 d，在肺部可見較多腫瘤結節(jié)或者轉移灶，同時不會因腫瘤結節(jié)過多導致動物死亡，可作為研究腫瘤轉移的理想細胞模型。因此，本研究選擇轉移能力中等的4TO7細胞通過脂質體轉染誘導多種鼠源miRNA表達，考察不同的miRNA的表達是否對4TO7細胞轉移特性改變發(fā)生影響。

圖5 mir-1935過表達促進腫瘤轉移Note：A，Tail vein xenografted tumors of control cells and cells expressingmir-1935；B，The number ofmetastasis foci in the lungs from mice inoculated with mir-1935-expressing 4To7 cells via tail vein was significantly increased compared with mice inoculated with negative control cells.Fig.5 mir-1935 over-expression accelerated tumor cellmetastasis

目前，已經有超過1000種人類miRNA被發(fā)現。miRNAs參與多種生物學功能，如調節(jié)細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等。一些miRNAs在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，其中一些miRNA抑制腫瘤發(fā)生，稱為tumor suppressor miRNA（TSmiRs）；另一些 miRNA促進腫瘤發(fā)生，則稱作 oncogenic miRNAs，即oncomiRs。Tavazoie SF等［2］發(fā)現miR-335、miR-126和miR-206具有腫瘤轉移抑制能力，其中miR-126能夠影響細胞的運動和增殖。miR-335則通過抑制轉錄因子SOX4的表達抑制乳腺癌轉移。由此可見，在腫瘤轉移過程中的miRNA是重要和多能的，而且 miRNA復雜的調節(jié)網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調控某個基因的表達。因此TSmiRs分子具有十分重要的臨床使用價值，發(fā)現更多與乳腺癌腫瘤轉移相關miRNA，將為乳腺癌的治療提供更多新的靶點。

mir-449a在多種固體腫瘤和腫瘤細胞系中低水平表達，包括前列腺癌，胃癌，脾癌和肺癌［16-20］。Noonan等［16］報道m(xù)iR-449a在前列腺癌中低表達，從而導致了前列腺癌細胞中組蛋白脫乙酰基酶-1 （histone deacetylases，HDAC-1）過表達，而HDAC-1是一種原癌基因。這暗示了mir-449a可能是一種抑癌基因，其表達異常可能與癌癥發(fā)生有關。羅等［20］報道m(xù)ir-449a在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織和細胞系中表達下調，和淋巴結轉移和低生存率相關，在體外實驗中可以通過c-Met靶點抑制腫瘤遷移和侵襲。迄今為止，還沒有mir-449a與乳腺腫瘤轉移相關的報道。本研究中，mir-449a過表達的4TO7細胞，和對照細胞相比，尾靜脈注射產生肺部轉移的能力下降，提示mir-449a對乳腺癌腫瘤轉移具有抑制作用。與之功能相反的是mir-1935，在本報道中表現出促進腫瘤轉移的作用，目前國際上還沒有類似的報道，也缺少對其功能的預測，因此有關其腫瘤轉移的調節(jié)機制還需深入的研究。

綜上所述，本研究首次通過尾靜脈移植瘤小鼠模型對鼠源miRNA過表達對乳腺腫瘤轉移的影響作用進行較大規(guī)模篩選，并已經獲得初步進展。從25種鼠源miRNA中篩選到2種與乳腺癌腫瘤轉移相關的miRNA：mir-449a抑制尾靜脈移植瘤生長，mir1935促進尾靜脈移植瘤生長。其余23種鼠源miRNA對小鼠乳腺癌細胞的轉移無明顯的促進或者抑制作用。未來我們將繼續(xù)展開工作，以期獲得更多參與乳腺癌轉移過程的miRNA。miRNA療法將有可能成為治療乳腺癌的有效方式，關于miRNA新功能的研究，將為乳腺癌的治療開啟一扇新的大門，為乳腺癌患者帶來希望。

［1］Ma L，Teruya-Feldstein J，Weinberg RA.Tumor invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer［J］.Nature，2007，449（7163）：682-688.

［2］Tavazoie SF，Alarcon C，Oskarsson T，etal.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis［J］.Nature，2008，451（7175）：147-152.

［3］Huang Q，Gumireddy K，Schrier M，etal.ThemicroRNAsmiR-373 and miR-520c promote tumour invasionand metastasis［J］.Nat Cell Biol，2008，10（2）：202-210.

［4］Park SM，Gaur AB，Lengyel E，et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2［J］.Genes Dev，2008，22（7）：894-907.

［5］Gregory PA，Bert AG，Paterson EL，et al.ThemiR-200 family and miR-205 regulate epithelial to mesenchymaltransition by targeting ZEB1 and SIP1［J］.Nat Cell Biol，2008，10：593 -601.

［6］Yu F，Yao H，Zhu P，et al.Let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells［J］.Cell，2007，131（6）：1109-1123.

［7］Valastyan S，Reinhardt F，Benaich N，etal.A pleiotrepicaly acting microRNA，miR-31，inhibits breast cancer metastasis［J］.Cell，2009，137（6）：1032-1046.

［8］Wu ZS，Wu Q，Wang CQ，et al.miR-340 inhibition of breast cancer cellmigration and invasion through targeting ofoncoprotein c-Met［J］.Cancer，2011，l：10.

［9］Milena S.Nicoloso，Riccardo Spizzo，et al.MicroRNAs-the micro steering wheel of tumour metastases［J］.Nature Reviews Cancer，2009，9：293-302.

［10］Nohata N，Hanazawa T，Enokida H，et al.microRNA-1/133a and microRNA-206/133b clusters：dysregulation and functional roles in human cancers［J］.Oncotarget，2012，3（1）：9-21.

［11］Chen Y，Song Y，Wang Z，et al.Altered expression of MiR-148a and MiR-152 in gastrointestinal cancers and its clinical significance［J］.J Gastrointest Surg，2010，14（7）：1170 -1179.

［12］Martin EC，Elliott S，Rhodes LV，et al.Preferential star strand biogenesis of pre-miR-24-2 targets PKC-alpha and suppresses cell survival in MCF-7 breast cancer cells［J］.Mol Carcinog，2014，53（1）：38-48.

［13］Hyun Min Jung，Rushi S.Patel，Brittany L.Phillips，et al.Chan Tumor suppressor miR-375 regulates MYC expression via repression of CIP2A coding sequence throughmultiplemiRNA-mRNA interactions［J］.Mol Biol Cell，2013，24（11）：1638 -1648.

［14］Zehavi L，Avraham R，Barzilai A，et al.Silencing of a large microRNA cluster on human chromosome 14q32 in melanoma：biological effects of mir-376a and mir-376c on insulin growth factor 1 receptor［J］.Mol Cancer，2012，11：44.

［15］Chen L，Tang Y，Wang J，et al.MiR-421 induces cell proliferation and apoptosis resistance in human nasopharyngeal carcinoma via downregulation of FOXO4［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，435（4）：745-50.

［16］Noonan EJ，Place RF，Pookot D，et al.miR-449a targets HDAC-1 and induces growth arrest in prostate cancer［J］.Oncogene，2009，28：1714-1724.

［17］Bou Kheir T，Futoma-Kazmierczak E，Jacobsen A，et al.miR-449 inhibits cell proliferation and is down-regulated in gastric cancer［J］.Mol Cancer，2011，10：29.

［18］Chen H，Lin YW，Mao YQ，et al.MicroRNA-449a acts as a tumor suppressor in human bladder cancer through the regulation of pocket proteins［J］.Cancer Lett，2012，320：40-47.

［19］Jeon HS，Lee SY，Lee EJ，et al.CombiningmicroRNA-449a/b with a HDAC inhibitor has a synergistic effect on growth arrest in lung cancer［J］.Lung Cancer，2012，76：171-176.

［20］LuoW，Huang B，Li Z，etal.MicroRNA-449a is downregulated in non-small cell lung cancer and inhibitsmigration and invasion by targeting c-Met［J］.PLoSOne，2013，8（5）：e64759.

［21］李小穎，馬元武，張連峰.三株熒光素酶標記的小鼠乳腺癌細胞在小鼠體內生長及轉移的比較［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2013，23（4）：1-4

The study of screening breast tumor suppressor m icroRNA in m ice

ZHANG Li，LIXiao-ying，SUN Cai-xian，ZHANG Xu，Chen Wei，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To investigate the functional role of 25 microRNAs in breast cancer，and to find new tumor suppressor microRNAs that may serve as specific targets of new gene therapies. M ethods Twenty-five microRNAs expression vectors were constructed and stably transfected into mouse mammary tumor cells 4To7 by Lipofectamine2000.Cells were selected with G418 and sorted by Flow cytometry.The cells in logarithmic phase were collected and 2×105cells/mouse was inoculated into BALB/cmice via tail vein.Lungswere harvested 14 days after tumor cell inoculation，and the number ofmetastasis fociwas counted.Results Mice inoculated with mir-449a-expressing 4To7 cells via tail vein developed reduced lungmetastases compared with mice inoculated with negative control cells.Mice inoculated with mir-1935-expressing 4To7 cells via tail vein developed increased lung metastases compared with mice inoculated with negative control cells.Other twenty-threemicroRNAs neither promoted nor inhibited lungmetastases of breast cancer.Conclusions Two of twenty-fivemicroRNA were identified to be associated with breast cancermetastasis.MiR-449amay play a tumour suppressor role in the regulation of migration and metastasis in breast cancer.miR-1935 transgenic over-expression promoted tumor growth and metastasis.

4TO7；Breast cancer；Micro RNA；Metastasis；Tail intravenous injection

張連峰，E-mail：Zhanglf@cnilas.org。

R332

A

1671-7856（2014）03-0072-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.015

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題“嚙齒類研發(fā)平臺創(chuàng)新藥物研究開發(fā)技術平臺建設”（2011ZX09307-302）；國家科技支撐計劃課題“神經和代謝疾病基因工程模型的建立”（2012BAI39B02）。

張麗，女，博士，E-mail：zhangliqq2004@126.com。

2014-02-17

設施設備