雄性大鼠膀胱出口梗阻兩種模型制作方法的比較研究

荊 強，王東文，高宏飛，劉 沖，史 驍

（1.山西醫科大學，太原山西 030001；2.山西醫科大學第一醫院泌尿外科，太原山西 030001）

雄性大鼠膀胱出口梗阻兩種模型制作方法的比較研究

荊 強1，王東文2，高宏飛2，劉 沖1，史 驍1

（1.山西醫科大學，太原山西 030001；2.山西醫科大學第一醫院泌尿外科，太原山西 030001）

目的通過采用恥骨后膀胱頸和會陰途徑球部尿道部分結扎兩種方法，建立雄性大鼠膀胱出口部分梗阻（paritial bladder outlet obstraction，pBOO）模型，并對所建模型進行鑒定和比較，為pBOO后膀胱重構（bladder reconstruction）的深入研究提供一種成活率高，復制性和穩定性較好的動物模型。方法80只健康雄性Wistar大鼠隨機分為三組：I組為假手術組（對照組），20只；II組為恥骨后途徑膀胱頸部分結扎組，30只；III組為會陰途徑球部尿道部分結扎組，30只。依據梗阻時間分別將I組、II組、III組大鼠隨機分為2周組和4周組，于術后2周和4周對大鼠行尿動力學檢測后，完整切除膀胱測其重量，將精囊腺組織和部分膀胱用4％甲醛固定，HE染色觀察組織學變化。結果II組和III組成活率分別為73.3％和80.0％，二者無統計學意義；I組、II組、III組建模手術時間分別為（9.75±2.29）、（17.33±3.54）、（10.77±2.44）min，II組與I組和III組比較差異均有統計學意義；I組、II組、III組的2周組和4周組逼尿肌漏尿點壓（detrusor leak point pressure，DLPP）分別為（26.31±2.32）、（27.34±3.93）、（24.68±2.39）mmHg和（26..42±2.41）、（34.23±3.01）、（32.63±3.20）mmHg，I組與II組和III組的4周組比較差異有統計學意義，II組和III組的2周組和4周組比較差異均有統計學意義。結論恥骨后途經膀胱頸部分結扎和會陰途徑球部尿道部分結扎兩種方法都能成功建立雄性大鼠pBOO模型，與恥骨后途徑相比，會陰途徑成活率高，手術操作時間短，復制性和穩定性好。

膀胱出口部分梗阻；恥骨后途徑；會陰途徑；模型，動物

膀胱出口部分梗阻（paritial bladder outlet obstraction，pBOO）是泌尿外科常見的疾病，尤其是男性患者，如良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）、尿道狹窄及先天性尿道畸形等都會導致pBOO。越來越多的研究證實pBOO患者伴隨的下尿路癥狀（lower urinary tract symptoms，LUTS）與尿路梗阻后導致的膀胱組織結構和功能改變密切相關。而且臨床上約35％～45％的pBOO/LUTS患者通過手術解除梗阻后，并不能有效的緩解儲尿/排尿期癥狀，表明尿路梗阻并非完全是致病原因［1］。目前對于pBOO/LUTS的病理生理機制仍然缺乏足夠的認識，因此有必要通過建立一種存活率高，復制性和穩定性較好的實驗動物模型，進一步探究其中的潛在機制，為尋求pBOO/LUTS更合理的治療方法提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠80只，SPF級，體重200g～250g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供（實驗動物質量合格證號SCXK-（軍）2012-0004）。山西醫科大學生理實驗中心動物房飼養，自由進水、飲食，保持動物籠具清潔干燥。大鼠在動物房適應3～5d后采用隨機分組的辦法將其分為三組：I組為假手術組（對照組），20只；II組為恥骨后途徑膀胱頸部分結扎組，30只；III組為會陰途徑球部尿道部分結扎組，30只。依據梗阻時間分別隨機將三組分為pBOO 2周組和pBOO 4周組。

1.2 pBOO動物模型的構建

1.2.1 恥骨后途徑膀胱頸部分結扎組：10％水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔內注射麻醉后將Wistar大鼠仰臥位固定，下腹部備皮，碘伏消毒后取下腹部正中（1.5～2.0）cm垂直切口，于腹直肌旁鈍性分離后打開腹腔，暴露膀胱，小心鈍性分離出膀胱頸，緊貼膀胱頸放置1mm硬膜外導管，于膀胱頸處穿過3-0絲線，以硬膜外導管為支撐，結扎膀胱頸。結扎標準：結扎程度盡可能松，線圈輕輕靠近即可，拔出硬膜外導管時結扎周圍組織不被牽動。然后拔出導管，逐層關閉切口。動物放入蘇醒室觀察，蘇醒后放回動物房。

1.2.2 會陰途徑球部尿道部分結扎組：準備工作如上所述，會陰消毒后取陰莖陰囊聯合處到陰囊中部長約1cm大小的正中垂直切口，鈍性分離出球部尿道后將尿道與海綿體分離，于此處穿過3-0絲線，緊貼尿道放置1mm硬膜外導管作為支撐，結扎尿道［2］。結扎標準同上，拔出導管，關閉切口。

1.2.3 假手術組：為了減少因感染導致大鼠死亡的數量，采用會陰切口，尿道分離如上所述，但不結扎，然后關閉切口。三組動物均完整記錄手術時間，于實驗當天開始以硫酸慶大霉素0.3mL～0.4mL于大腿內側肌肉注射，連用3d。術后第1天開始自由飲水，限制飲食，保持籠具清潔干燥，所有實驗大鼠均在相同條件下飼養。

1.3 尿動力學檢查

術后分別對pBOO 2周組和pBOO 4周組通過恥骨上膀胱造瘺途徑行尿動力學檢測，以20％烏拉坦（1g/kg體重）腹腔麻醉，大鼠仰臥位固定，碘伏消毒下腹部后取正中切口，暴露膀胱，用眼科剪在膀胱頂部剪一小口，將備好的兩根硬膜外導管（提前用膠帶將兩根導管捆綁在一起，將進入膀胱的一端剪成斜面）插入，穿過2-0絲線結扎，使導管固定于膀胱且不漏尿，結扎時被結扎膀胱組織盡可能少。擠壓排空膀胱尿液后，兩根導管分別連接BL-420生物機能實驗系統的壓力傳感器和微量灌注泵，啟動灌注泵，以0.2mL/min的速度灌注37℃生理鹽水并開始測壓。當尿道口出現第一滴尿液時，記錄的即刻壓力為漏尿點壓力（leak point pressure，LPP）。大鼠行尿動力學檢查前已被麻醉，無應力動作出現，因此LPP可以被視為逼尿肌漏尿點壓（detrusor leak point pressure，DLPP）［3］。

1.4 膀胱標本稱重

尿動力檢測完畢后，仔細分離膀胱周圍組織，暴露膀胱頸后，自結扎線近端處切取膀胱，去除脂肪組織，用生理鹽水沖洗膀胱表面血漬，濾紙吸干表面液體，測膀胱濕重。

1.5 組織學檢查

部分膀胱、精囊腺組織4％甲醛液固定12h后常規脫水，石蠟包埋，3.0μm厚切片，置70℃烤箱15h，低溫保存，HE染色，光鏡觀察。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 動物模型的成活率

恥骨后膀胱頸部分結扎組和會陰途徑球部尿道部分結扎組各30只，分別死亡8只和6只，兩組的成活率分別為73.3％和80.0％，χ2檢驗P＞0.05，兩種pBOO動物模型成活率無統計學差異。在死亡的15只wistar大鼠中，結扎過緊6只，其中Ⅱ組2只，Ⅲ組4只；輸尿管損傷2只全部為Ⅱ組；感染4只，Ⅱ組3只，Ⅲ組1只；切口裂開2只，Ⅱ組、Ⅲ組各1只；麻醉過深1只為sham組（圖1）。

2.2 模型制作手術時間

恥骨后膀胱頸部分結扎組、會陰途徑球部尿道部分結扎組和假手術組的模型制作手術時間分別為（9.75±2.29），（17.33±3.54）和（10.77±2.44）min，單因素方差分析檢驗發現Ⅰ組和Ⅲ組實驗動物模型制作的手術時間顯著低于Ⅱ組（P＜0.05）。

2.3 尿動力學結果

各組DLPP結果見表1，II組與III組的2周組比較差異有統計學意義（P＜0.05），I組的4周組顯著低于II組和III組的4周組（P＜0.01），II組和III組的2周組和4周組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。II組的2周組DLPP比I組稍高，4周組顯著高于I組，說明梗阻4周后膀胱重構明顯。III組的2周組DLPP較I組輕度下降，原因是在膀胱測壓過程中，部分尿液返流入精囊腺，壓力經其分流，出現膀胱壓力輕度下降。梗阻4周后膀胱重構進展，DLPP增加，但低于恥骨后途徑4周組，這也與壓力返流有關（圖2）。

表1 各組在不同時間點DLPP測定結果（mmHg，n=65）Tab.1 Measrements of detrusor leak point pressure in the 2-week and 4-week subgroups（mmHg，n=65）

2.4 膀胱濕重

各組膀胱濕重結果見表2，Ⅰ組和Ⅱ組在2周時間點上的膀胱濕重有統計學差異（P＜0.05），Ⅰ組和Ⅱ組、Ⅲ組在4周時間點上的膀胱濕重差異有統計學意義（P＜0.05），II組和Ⅲ組分別在2周和4周不同時間點上的膀胱濕重有統計學顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 手術并發癥死亡大鼠Fig.1 Summary of operative complications and death in the rats

圖2 各組不同時間點DLPP柱狀圖Fig.2 Histogram of detrusor leak point pressure in the 2-week and 4-week subgroups

表2 各組在不同時間點的膀胱濕重（g，n=65）Tab.2 Bladder wet weights in the 2-week and 4-week subroups（g，n=65）

2.5 組織學檢查

梗阻2周后膀胱組織結構尚未發生明顯變化，4周后逼尿肌細胞增生、肥大，逼尿肌層變厚，平滑肌細胞之間及肌束之間膠原纖維增生（圖3）。精囊腺HE染色可見恥骨后途徑無明顯擴張，而會陰途徑腺腔明顯擴張（圖4）（圖3，4見彩插5，6）。

3 討論

pBOO模型目前主要的建模方法是通過手術結扎的方法人為的造成動物膀胱流出道部分梗阻，盡管文獻報道雄性和雌性均可制作模型，但以雌性大鼠制作pBOO模型較多。雌性大鼠模型存在致命性的弊端，因性別差異體內激素的不同，男女患者的病因、發病機制、治療也不盡相同，臨床上pBOO/LUTS的患者大部分為男性，并有文獻指出膀胱逼尿肌（detrusor）是激素敏感性組織［4］，因此采用雌性大鼠pBOO動物模型研究pBOO后膀胱重構的機制不甚合理。雄性大鼠尿道中部陰莖懸韌帶將尿道固定在腹壁上，陰莖由此向后彎曲成銳角，解剖結構的特殊性導致其行導尿時導尿管不能通過折角處，反而極易損傷尿道［5］。另一個原因是雄性大鼠存在精囊腺，在充盈性膀胱測壓過程中因腺體壓力返流而導致壓力不穩定，以上兩方面的原因限制了雄性大鼠制作pBOO動物模型的應用。有文獻報道雄性大鼠采用恥骨后途徑膀胱頸部分結扎法能成功制作pBOO動物模型［6，7］，但樣本量少。本實驗采用恥骨后途徑膀胱頸和會陰途徑球部尿道部分結扎法制作模型，并對所建模型進行鑒定和比較，為pBOO后膀胱重構（bladder reconstruction）的深入研究提供一種成活率高，復制性和穩定性較好的動物對象。

模型制作過程中普遍采用一根校準棒作為支撐，絲線結扎后去除校準棒。然而校準棒外徑不一，如18gauge、20gauge的血管導管，1mm的硬膜外導管等［8-10］。但也有文獻報道體重在300～350g的雄性SD大鼠利用1.7mm校準棒作為支撐成功建立膀胱出口梗阻動物模型［11-12］。校準棒有內塞和外壓兩種方法，文獻多以內塞為主，本課題組采用1mm硬膜外導管外壓造成梗阻，這樣既避免了尿道損傷，又保證了大鼠排尿時膀胱頸受到限制，而且操作相對簡單。結扎的松緊度是建立梗阻模型和模型成活率的關鍵因素，結扎過松不能形成有效梗阻，過緊成活率太低。本實驗中80只雄性Wistar大鼠，死亡15只：其中6只因嚴重尿潴留死亡，分析原因系結扎過緊，解剖后發現膀胱破裂，腹腔大量腹水或膀胱極度充盈，內含透明清亮尿液或膀胱呈紫葡萄外觀，切開后溢出血性膿液。本課題組的心得是暴露膀胱頸或者球部尿道后，放置1mm硬膜外導管作為支撐結扎，結扎程度盡可能松，線圈輕輕靠近即可，拔出硬膜外導管時結扎周圍組織不被牽動為準。2只因損傷輸尿管死亡，術后解剖發現被損傷輸尿管近端擴張積水，積水稍渾濁，腎周可見積膿。分析原因系出血致解剖層次不清，未分離出輸尿管，盲目結扎。4只因切口、尿道口感染死亡，2只因切口裂開，大鼠咀咬死亡，這歸因于縫合技術原因，進針點距切緣近，加上切口周圍皮膚和皮下水腫疏松，當膀胱充盈過大時，將縫合切口撐開。1只因麻醉過深死亡。

恥骨后途徑膀胱頸部分結扎組需切開下腹部，分離尿道，于膀胱頸處部分結扎尿道，此法操作繁瑣，易損傷輸尿管及膀胱周圍血管叢。恥骨后途徑切口約為1.5～2cm，比會陰途徑切口大，易引起感染［13］。本實驗也證實了這種觀點，感染死亡的大鼠總共4只，其中恥骨后途徑3只。會陰途徑僅需會陰一大小約1cm的垂直切口即可，手術創傷小，涉及的解剖結構少，操作簡單，手術時間短。兩組的成活率相比，雖無統計學意義，但會陰途徑手術并發癥少，成活率高于恥骨后途徑。通過兩種方法手術時間、成活率的比較和手術并發癥的統計，會陰途徑比恥骨后途徑具有明顯優勢。

行充盈行膀胱測壓時，目前主要有兩種方法：一種是經原切口切開皮膚，松解尿道結扎線，經尿道口置入膀胱測壓管進行測壓［14］。該法理論上可行，但實際操作中難以完成，主要原因是長時間梗阻后結扎處已形成瘢痕狹窄，即使去除結扎線，導管也難以通過狹窄處。另一種方法是通過恥骨上膀胱造瘺進行膀胱測壓。部分研究者的做法是暴露膀胱后，用頭皮針穿刺膀胱，直接做膀胱測壓。本研究發現隨著膀胱壓增加，頭皮針極易脫出膀胱而使測壓失敗。也有部分研究者在膀胱頂部采用荷包縫合，將測壓管固定，這種方法最主要的問題是縫扎的膀胱組織較多，膀胱有效容量相對減少，加大實驗誤差［15］。文獻報道測壓時尿動力儀與微量灌注泵是通過一個三通管相連，進入膀胱的灌注管和測壓管是一根單腔導管，影響測壓的真實數據［16］。本課題組在測壓時進行改良：暴露膀胱后，用眼科剪在膀胱頂部剪一小口，將備好的兩根硬膜外導管插入，絲線結扎，使導管固定于膀胱，結扎時被結扎膀胱組織盡可能少。這樣做既保證導管固定牢靠，又避免了單根單腔導管對測壓結果的影響。充盈性膀胱測壓結果顯示：恥骨后途徑2周組DLPP比假手術組稍高，4周組DLPP顯著高于假手術組，說明梗阻2周后膀胱組織結構尚未發生明顯改變，4周后膀胱組織結構發生變化，逼尿肌平滑肌細胞增生、肥大，逼尿肌層變厚，平滑肌細胞之間及肌束之間膠原纖維增生。會陰途徑2周組DLPP較假手術組輕度下降，原因是在膀胱測壓過程中，發生逼尿肌收縮排尿時，部分尿液返流入精囊腺，壓力經其分流，出現膀胱壓力輕度下降［17］。梗阻4周后膀胱重構［18］進展，DLPP增加，但低于恥骨后途徑4周組，這也與精囊腺體壓力返流有關。

基礎研究開展的前提是動物模型的建立，目前pBOO動物模型存在的主要問題是盡管選擇了一個校準棒作為結扎松緊的標準，直徑多浮動在1mm的范圍內，但文獻中大鼠的體重不一致，較難形成較一致的梗阻表現。因此還需要進一步標化模型，建立一個成活率更高，復制性和穩定性更好，操作更簡單的雄性大鼠pBOO動物模型。

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Comparison of two methods to establish male rat model of partial bladder outlet obstruction

JIN Qiang1，WANG Dong-Wen2，GAO Hong-Fei2，LIU Chong1，SHI Xiao1
（1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Department of Urology，the First Hospital Affiliated to Shanxi Medical University，Taiyuan 030001）

ObjectivesTo compare the retropubic and perineal approaches in establishing partial bladder outlet obstruction in male rats，and provide an effective and reliable method to prepare the rat model to serve researches on mechanism of bladder reconstruction.MethodsEighty healthy male Wistar rats were used in this study，and randomly divided into three groups.Group I：Twenty rats were used for sham operation with a perineal incision.Group II：Thirty rats were chosen for midprostatic obstruction using a retropubic approach.Group III：Thirty rats were used for bulbous urethral obstruction through a perineal incision.The groups II and III were further randomly divided into 2-week and 4-week subgroups.After 2 and 4 weeks，respectively，all experimental rats were anesthetized and underwent cystometricevaluation.Then the rats were sacrificed，and the organs including bladder and seminal vesicle were removed.The bladder body was weighted and recorded，and then a portion of the bladder body and the seminal vesicle were fixed in 4％paraformaldehyde solution.Remaining bladder tissue was saved in the liquid nitrogen.ResultsThe survival rate of group II and III was 73.3％and 80.0％，respectively（P＞0.05）.The operation time in the three groups was（9.75±2.29），（17.33±3.54）and（10.77±2.44）min，respectively.The operation times of groups I andⅢ were significantly shorter than that of the group II（P＞0.05）.DLPP of the group 1-and 2-week and 4-week subgroups of Groups II and III were（26.31±2.32），（27.34±3.93），（24.68±2.39）mmHg and（26.42±2.41），（34.23±3.01），（32.63±3.20） mmHg，respectively，showing a significant difference between the group I and the 4-week sbugroups of Group II and III，and between the 2-week and 4-week subgroups of groups II and III（P＜0.05）.ConclusionsBoth the retropubic and perineal approaches can be used to successfully establish a partial bladder outlet obstruction in male rats.Compared with the retropubic approach，the perineal approach has advantages such as shorter operation time，a higher survival rate，better reproducibility and stability of the animal models，and that this rat model better resembles the progress of human male partial bladder outlet obstruction.

Partial bladder outlet obstruction；Retropubic approach；Perineal approach；Animal mode；Rat

R33

A

1671-7856（2014）02-0052-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.004

山西省回國留學人員科研資助項目（No.2007-47）；山西省青年科技研究基金租住項目（No.2012021034-1）。

荊強（1986-），男，研究方向：尿動力基礎與臨床。E-mail：jq0310urology@126.com。

王東文（1964-），男，博士生導師，研究方向：尿動力基礎與臨床，泌尿系腫瘤和微創泌尿外科學。E-mail：urology2007@126.com。

2013-12-31