TGF-β/Smad與Wnt/β-catenin在博萊霉素致大鼠肺纖維化中的表達及相互作用

肖 穎，楊濤濤，周衛民，朱科燕，壽旗揚，蔡月琴，陳方明，陳民利

（浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053）

TGF-β/Smad與Wnt/β-catenin在博萊霉素致大鼠肺纖維化中的表達及相互作用

肖 穎，楊濤濤，周衛民，朱科燕，壽旗揚，蔡月琴，陳方明，陳民利

（浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053）

目的觀察TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路相關基因在肺纖維化大鼠模型肺組織中的表達，探討兩條通路對肺纖維化的影響及其相互作用。方法取Wistar大鼠36只，隨機分為正常對照組和肺纖維化模型組，每組18只。采用氣管內注入博來霉素（BLM）建立Wistar大鼠肺纖維化模型，每組分別于第14、21和28天處死大鼠各6只；取肺組織稱重，測定肺組織中HYP、IL-1β水平，觀察肺組織Col-I、IL-1β、TGF-β1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1 mRNA的表達，并進行HE染色和Masson膠原染色。結果（1）與正常對照組比，造模后14～28d大鼠肺指數均明顯升高（P＜0.01）；肺組織HE染色呈現明顯的肺纖維化病理改變，Masson染色結果可見造模后14～28d肺間質藍色膠原呈漸進性增加。（2）造模后第14天，肺組織IL-1β含量、IL-1β mRNA相對含量均顯著升高（P＜0.01），隨后逐漸降低，至造模后第28天IL-1β表達量接近正常水平（P＞0.05）。（3）造模后14～28d大鼠肺組織HYP含量、Col-I mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.01）。（4）與正常組相比，模型組中TGFβ1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-Catenin、LEF-1 mRNA表達顯著增加（P＜0.01），且TGFβ1、Smad3 mRNA分別與Wnt1、LEF-1、β-catenin mRNA的表達呈顯著正相關。結論TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路相關基因在博來霉素致大鼠肺纖維化中表達上調，兩條通路對肺纖維化可能有促進作用且它們間可能存在一定聯系。

博萊霉素；肺纖維化；TGF-β1；β-catenin

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性間質性肺部疾病，是以彌漫性肺泡炎、肺泡結構紊亂、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）大量沉積等為特征的組織病理學改變［1］。肺纖維化發病過程主要分為兩個階段，前期炎癥反應階段和后期纖維化階段［2］，并認為肺纖維化是由肺組織受損后修復調節失控、重建異常所引起的病變，是一系列細胞因子、生長因子通過多條細胞信號轉導通路共同調控的結果［3］。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）被認為是最為關鍵的致纖維化因子之一，它主要通過TGF-β/Smad通路而在肺纖維化過程中發揮作用［4］。博萊霉素（bleomycin，BLM）致大鼠肺纖維化模型病理學改變與人類肺纖維化十分相似，是當今比較公認的致模方法［5］。最近研究發現，Wnt/β-catenin通路的活化可促進纖維化疾病的發生［6］，且TGF-β/Smad通路和Wnt/β-catenin通路間存在一定聯系［7］，但目前關于Wnt通路在大鼠纖維化中的研究較少，同時TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin兩條途徑的相關基因在BLM致大鼠肺纖維化模型中表達變化情況尚未見報道。因此，本文采用氣管內注射博萊霉素復制大鼠肺纖維化模型，觀察造模后14、21、28d大鼠肺組織TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路中相關基因的表達，探討兩條通路在博萊霉素誘導大鼠肺纖維化過程中的作用及相互關系，為該模型在肺纖維化研究中的應用奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與飼養環境

SPF級雄性Wistar大鼠，6～7周齡，體重（200～220）g，36只，來源于上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（滬）2012-0002］；飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障環境［SYXK（浙）2012-0001］，飼養室溫度：（20±2）℃，相對濕度：50％～60％，光照：12h/12h明暗交替；每籠3只飼養，自由飲食；并在實驗過程中按實驗動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

注射用鹽酸博萊霉素，日本化藥株式會社；Masson三色染色試劑盒，珠海貝索生物技術有限公司；羥脯氨酸（HYP）、TGFβ1、白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒，杭州誠維科技公司；總RNA提取裂解液（RNAiso plus）、RT-PCR反轉錄試劑盒和熒光定量試劑均購于大連Takara公司；PCR引物由上海生工生物公司合成。Nikon生物倒置顯微鏡（日本Nikon公司）、連續光譜酶標儀（美國Thermo公司）、Nano-drop微量核酸測定儀（美國Thermo公司）、PTC-200定性PCR儀（美國Bio-Rad公司）、IQ5熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 動物分組與模型制備

取體重（200～220）g的雄性Wistar大鼠36只，適應性飼養1周后，隨機分為正常對照組（control）和模型組（model），每組18只。參照Szapie等［8］方法進行造模，模型組大鼠用3％戊巴比妥鈉溶液45mg/kg腹腔注射麻醉，微創暴露氣管，大鼠氣管內注入博萊霉素（5mg/kg）水溶液0.2mL～0.3mL，正常對照組麻醉后氣管內注入等量生理鹽水，注射完畢后立即將大鼠直立旋轉30s，盡量使藥液在肺內均勻分布，每組分別于造模后14d、21d和28d取大鼠6只大鼠，稱重后用3％戊巴比妥鈉溶液45mg/kg腹腔注射麻醉，開胸取肺組織，用濾紙吸去表面血液和體液后稱重，計算肺指數；并取一側肺組織置于10％中性甲醛中固定；另一側肺組織分成一式3份保存于-80℃，用于分子檢測。

1.4 肺組織病理學觀察

肺組織經10％中性甲醛固定后，按常規病理方法脫水、包埋、切片，進行HE、Masson染色，光學鏡下觀察肺組織病理學改變；參照Szapie等［8］的方法用Masson染色評定肺組織纖維化程度。

1.5 肺組織中HYP、IL-1β含量測定

取凍存肺組織300mg，分別裝入EP管，加入PBS液，冰水中用超聲細胞粉碎機做組織勻漿，離心15min，取上清液，用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定肺組織勻漿液HYP和IL-1β含量。

1.6 肺組織纖維化相關細胞因子mRNA表達

取凍存肺組織50mg～80mg，按Trizol試劑盒說明書操作，提取總RNA并逆轉錄成cDNA。基因引物由上海生工生物公司設計并合成，引物序列見表1。將cDNA用RT-PCR儀進行擴增，所有反應信息資料由Bio-Rad iQ5 PCR儀收集，CT值通過計算機軟件測定，轉錄水平通過公式2-ΔΔCT計算。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 肺組織大體觀察

通過氣管內注入BLM后，大鼠體型明顯消瘦（P＜0.01），體重增加緩慢，至造模后第28天大鼠體重與正常組相比仍存在顯著差異（P＜0.01）（圖1）。解剖觀察發現正常組大鼠肺臟呈淡紅色，表面光滑，彈性良好，未見出血點；造模后14d肺組織呈黃白色，局部見大小不等結節樣改變，雙肺表面見出血點和瘀斑；造模后21d，肺組織呈灰白色，雙肺表面出血點較14d有所減少，出現有少許較淺凹溝；至造模后28d肺組織體積縮小，質地變硬，顏色蒼白，表面粗糙不平，可見小片狀、條索狀凹凸不平的蒼白凹溝。圖1結果顯示，與正常對照組比，大鼠造模14d后肺指數顯著升高（P＜0.01），造模后第21天和第28天肺指數雖有所下降，但仍顯著高于正常對照組（P＜0.01）。

2.2 肺組織病理學觀察

HE染色結果顯示，正常對照組大鼠肺組織結構清晰，肺泡間隔未見增厚，無水腫、炎癥及纖維化表現。模型組大鼠造模后第14天，肺泡腔和肺間質有炎性細胞浸潤，肺泡間隔增厚，有纖維結締組織增生，肺泡腔變窄，出現纖維化；造模后第21天，肺泡炎較14d時有所減輕，少量炎癥細胞浸潤，成纖維細胞大量增生，纖維組織呈條索樣瘢痕改變；造模后第28天，肺組織僅有少量炎癥細胞浸潤，肺泡結構破壞、萎縮或消失，成纖維細胞大量增生，纖維組織呈斑片狀分布（圖2-a，圖2見封底）。Masson染色結果，正常對照組大鼠肺組織中未見藍色膠原沉積，而造模后第14天有少量藍色膠原沉積，隨時間延長藍色膠原呈進行性增多，至第21、第28天肺間質出現大量的藍色膠原沉積（圖2-b，圖2見封底）。

2.3 肺組織IL-1β含量和IL-1βmRNA的表達

由圖3可見，與正常對照組比，模型組肺組織中IL-1β含量、IL-1β mRNA相對表達量均在造模后第14天明顯升高（P＜0.01），此后均有所降低，至造模后第28天時IL-1β含量仍高于正常對照組（P＜0.05），但IL-1β mRNA表達量已降為正常水平（P＞0.05）。

注：與正常對照組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。（a）模型組大鼠體重增加緩慢，與正常組相比存在顯著差異（P＜0.01）。（b）與正常組相比，大鼠造模14d后肺指數顯著升高（P＜0.01），造模后第21天和第28天肺指數雖有所下降，但仍顯著高于正常對照組（P＜0.01）。圖1 肺纖維化大鼠體重和肺指數的變化（n=6）Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.normal control group.（a）In the model groups，the body weight increased slowly and significantly different from that of the normal group（P＜0.01）.（b）Compared with the normal group，the lung index was significantly increased on 14 days after bleomycin administration.The lung index was decreased 21 and 28 days after model building，but were still significantly higher than that in the control group.Fig.1 Changes of the body weight and pulmonary index of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rats

注：與正常對照組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。模型組IL-1β含量、IL-1β mRNA相對含量在造模后第14天升高（P＜0.01），第28天時IL-1β含量仍高于正常組（P＜0.05），IL-1β mRNA表達量降為正常水平（P＞0.05）。圖3 大鼠肺組織IL-1β含量和IL-1β mRNA相對含量的比較（n=6）Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.normal control group.Compared with the normal groups，the content of IL-1β and expression of IL-1β mRNA are significantly increased after operation（P＜0.01），and then declined.On 28 days after model building the contents of IL-1β remain higher than those in the normal groups，while the expression of IL-1β mRNA is near the normal level（P＞0.05）.Fig.3 Comparison of IL-1β content and mRNA expression of IL-1β in the lung tissue of rats

2.4 肺組織HYP含量、Col-ⅠmRNA表達

與正常對照組比，模型組肺組織中HYP含量、Col-I mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01），且造模后第14天至第28天時肺組織中HYP含量、Col-I mRNA相對表達量均呈持續性顯著上升（P＜0.01），見圖4。

2.5 TGF-β/smad和Wnt/β-catenin通路相關基因表達及其相關性分析

與正常對照組比，給予博萊霉素后第14天肺組織中TGFβ1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1 mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.01），之后逐漸下降，但均顯著高于正常對照組（P＜0.01），見圖5。肺組織中TGFβ1 mRNA表達與Wnt1，β-catenin，LEF-1 mRNA表達呈顯著正相關，相關系數分別為0.650、0.730、0.747（P＜0.01）；Smad3 mRNA與Wnt1，β-catenin，LEF-1 mRNA表達趨勢一致，其相關系數分別為0.727、0.813、0.764（P＜0.01）；此外，α-SMA mRNA表達與TGFβ1，Smad3，Wnt1，βcatenin及LEF-1 mRNA表達呈顯著性正相關，相關系數分別為0.721、0.843、0.812、0.673、0.755（P＜0.01），見圖5。

注：與正常對照組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。模型組HYP含量、Col-ⅠmRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01），造模后14～28d HYP含量、Col-I mRNA相對表達量均持續上升。圖4 大鼠肺組織HYP含量、Col-ⅠmRNA相對含量的比較（n=6）Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.normal control group.Compared with the normal groups，the contents of HYP and Col-I mRNA are significantly increased after operation（P＜0.01），and continue to increase during 14 to 28 days after model building.Fig.4 Comparison of HYP，Col-I mRNA contents in the lung tissues of rats.

注：與正常對照組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。模型組TGFβ1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1 mRNA相對含量顯著升高（P＜0.01），造模后14～28天逐漸下降，28d時仍顯著高于正常對照組（P＜0.01）。圖5 大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、α-SMA、Wnt1、β-catenin、LEF-1mRNA表達情況比較（n=6）Note：*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.normal control group.Compared with the normal groups，the expression of TGF-β1，Smad3，α-SMA，Wnt1，β-catenin，LEF-l are significantly increased after operation（P＜0.01），and then decline.On the 28 days after model building the level remains higher than that in the normal groups（P＜0.01）Fig.5 Comparison of the expression of TGF-β1，Smad3，α-SMA，Wnt1，β-catenin and LEF-1 in the lung tissue of rats.

3 討論

肺纖維化是許多肺系慢性疾病后期的共同結局，其病理特點是早期肺泡炎和后期成纖維細胞大量增生及膠原進行性沉積并取代正常的肺組織結構［1］。博萊霉素致大鼠肺纖維化模型病理學改變與人類肺纖維化極為相似［5］。有文獻報道［2］，大鼠氣管內注入BLM后，纖維化疾病發展基本上可以分為三個階段，炎癥反應階段（造模后3～7d），間質細胞增生階段（造模后7～14d）和彌漫性纖維化階段（造模后14～28d）。本實驗通過氣管內注入博萊霉素建立大鼠肺纖維化模型，研究結果發現造模14d后IL-1β含量和mRNA表達量均明顯升高，隨后逐漸降低，至造模后第28天時IL-1β mRNA相對表達量幾乎接近正常水平。另外，HE染色結果可見造模后14～28d炎性細胞浸潤明顯減少，提示BLM誘導大鼠肺纖維化后期炎癥反應逐漸減弱。膠原代謝處動態平衡對維持肺泡正常結構和功能有著十分關鍵的作用，肺纖維化的改變主要為膠原代謝失衡，其中Col-I型和Col-III型代謝失衡起主要作用，肺組織中Ⅲ型膠原過度沉積能夠逆轉，而Ⅰ型膠原的過度沉積將導致不可逆的肺纖維化［9］。HYP是機體膠原蛋白的主要成分之一，且為膠原蛋白所特有，其含量可作為膠原組織代謝的重要指標，常用于判斷肺纖維化程度。本實驗結果顯示，造模后第14天至第28天期間肺組織中HYP含量和Col-I mRNA的表達量均顯著升高，肺組織Masson染色結果亦發現造模后第14天膠原纖維明顯增生，且膠原沉積隨時間的延長而呈進行性增加。由此可見，BLM可誘導大鼠形成明顯肺纖維化，并且BLM致大鼠纖維化后期是以肺間質纖維化為主，與文獻報道相一致。

TGF-β1被公認為是纖維化形成與發展的啟動樞紐，能促進成纖維細胞趨化，促使膠原合成和改變細胞外基質成分。Smads蛋白是TGF-β下游信號轉導和調節分子，磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成Co-Smads入核調控靶基因轉錄，從而誘導纖維化改變［10］。Wnt/β-catenin通路是調控細胞增殖、分化的重要途徑，β-catenin是Wnt通路中關鍵的信號轉導分子，創傷等誘因激活Wnt蛋白表達分泌，使得β-catenin無法磷酸化，游離的β-catenin在細胞漿蓄積到一定量后，進入細胞核與TCF/LEF結合，從而激活靶基因轉錄［11］。近來研究表明，Wnt/β-catenin通路的激活可導致肺纖維化形成［12］。TGF-β/smad與Wnt/β-catenin通路在多個環節存在交互作用［13］。在人類真皮成纖維細胞中，TGF-β和Wnt信號轉導通路可以共同調節膠原、基質金屬蛋白酶等的表達，TGF-β1作用于皮膚成纖維細胞后，可誘發β-catenin表達升高［14］。本研究結果顯示，模型組中TGFβ1、β-catenin、Col-1 mRNA相對含量均顯著高于正常組，且造模第14～28天，TGF-β1與β-Catenin mRNA變化趨勢一致，呈顯著性正相關，說明TGFβ1可能通過激活β-catenin表達從而促進BLM致肺纖維化過程。此外，TGFβ1可以通過Smad3和Smad4激活淋巴細胞增強因子（TCF/LEF）轉錄目的基因，而TCF/LEF是Wnt通路下游信號轉導分子，它可以刺激基質金屬蛋白酶和結締組織大分子等的表達調節纖維化［15］。本實驗檢測亦發現造模后第14天TGFβ1、Smad3和LEF-1 mRNA的表達量均明顯升高，至21d和28d時其表達量有所降低且存在一定相關性，提示TGFβ1可能通過其下游信號分子Smad3實現對Wnt通路中LEF的表達上調而導致肺纖維化形成。近年來研究證實［16］，肌成纖維細胞與肺纖維化發生、發展密切相關，上皮間質轉化（EMT）是肌成纖維細胞細胞來源的一個重要途徑。另有文獻表明［17］，TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路均可促使EMT發生。本實驗結果發現，模型組中，α-SMA、TGFβ1、Smad3、Wnt1、β-catenin和LEF-1 mRNA表達都高于正常對照組，且它們變化情況均與α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）存在顯著性正相關，α-SMA的大量表達是肌成纖維細胞細胞分化的一個重要標志［16］，故我們推測TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin途徑可能通過共同促使EMT發生從而誘導肌成纖維細胞分化而達到致肺纖維化作用。

綜上所述，在博萊霉素誘導大鼠肺纖維化過程，TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路中相關基因表達上調，說明這兩條通路的活化可能導致纖維化發生，它們間也許存在一定的聯系。TGFβ1可能通過激活β-catenin，進而使得成纖維細胞中膠原過度分泌，影響肺纖維化形成；同時TGFβ1也可能通過Smads蛋白調節Wnt通路下游信號分子LEF活性，進而上調基質金屬蛋白酶和其它結締組織大分子的表達促進纖維化進程；此外TGFβ和Wnt通路還可能通過共同激活EMT發生導致肌成纖維細胞大量產生達到促肺纖維化作用。目前關于這兩條通路在肺纖維化中作用及相互間關系的研究還處于初步階段，其具體機制有待我們進一步確認及深入研究。

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Expression and interaction of TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin signaling pathway-related genes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats

XIAO Ying，YANG Tao-tao，ZHOU Wei-min，ZHU Ke-yan，SHOU Qi-yang，CAI Yue-qin，CHEN Fang-ming，CHENmin-li
（Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

ObjectiveTo observe the expression of TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin signaling pathway-related genes in the lung tissue and explore the function and interaction of the two pathways in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats.MethodsThirty-six male Wistar rats were randomly divided into two groups，the control group（n=18） and model group（n=18）.The rats were intratracheally injected with saline and bleomycin solutions，and killed on the 14th，21st and 28th days after operation，respectively.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to determine the levels of HYP and IL-1β in the lung tissues.Real-time PCR was used to detect the expression of IL-1β，Col-I，TGF-β1，Smad3，α-SMA，Wnt1，β-catenin，and LEF-1mRNA in the lung tissues.Histopathological examination of thelung tissues was done with hematoxylin-eosin（HE）and Masson staining.Results（1）Compared with the normal group，the lung indexes were significantly increased during the 14 to 28 days after bleomycin administration（P＜0.01）.The pathological changes were in accordance with pulmonary fibrosis，and the blue collagens by Masson staining were gradually increased in the pulmonary interstitium at 14 to 28 days after model building.（2）Compared with the normal group，the IL-1β content and the expression of IL-1β were significantly increased on the 14th day after bleomycin administration（P＜0.01）and then declined gradually，and on the 28 day the expression of IL-1β was near to the normal level（P＞0.05）.（3）At 14 to 28 days after operation，the content of hydroxyproline and the expression of Col-I were increased successively，and were significantly higher than those in the control group（P＜0.01）.（4）Compared with the normal group，the expression of TGF-β1，Smad3，α-SMA，Wnt 1，β-catenin，LEF-l were significantly increased after operation（P＜0.01），and there was a significant positive correlation between them.ConclusionsThe expression of TGF-β/Smad and Wnt/βcatenin pathway-related genes are increased in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats.The two pathways may promote the process of fibrosis and there may be some relationship between them.

BLM；Pulmonary fibrosis；TGF-β1；β-catenin；Rat

R33

A

1671-7856（2014）02-0063-07

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.014

“浙江省衛生高層次創新人才培養工程項目”資助（編號：ZWR2008-43）。

肖穎（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥藥理與比較醫學。E-mail：zhulinfengsmile@163.com。

陳民利（1963-），女，教授、碩士，研究方向：實驗動物與比較醫學，E-mail：cmli991@aliyun.com。

2013-12-12