雞滑液囊支原體的分離鑒定及耐藥性分析

顧的樂

（新興縣溫氏食品聯營有限公司，廣東 云浮 527400）

由雞滑液支原體（Mycoplasma Synoviae，MS）引起的腿病是雞的一種常見、多發性傳染病。該病在規模化雞場中分布廣泛、危害大，主要引起4～16周齡的雞感染發病，并迅速水平傳播，雞群發感染后發育受阻，甚至引發免疫抑制，容易繼發或伴發其它疫病。近年來，由于環境因素或雞群不良狀態等不利因素的影響，該病在免疫雞群中的爆發現象日趨嚴重，對雞業養殖生產中控制及預防帶來嚴峻的考驗。因此，本研究應用實驗室方法分離廣東地區疑似MS病原，利用PCR技術、觀察菌落形態、病例復制等方法對病原進行鑒定，并對MS分離株進行敏感藥物的篩選，為臨床有效防控該病提供較為可靠的參考。

一、材料與方法

1 材料

1-1 病料：收集廣東某地區疑患MS感染雞群的氣管、支氣管、肺、腿關節等組織和分泌物。

1-2 雞胚：雞胚 9日齡健康雞胚。

1-3 實驗動物： 10日齡SPF雞。

1-4 試劑： PCR擴增試劑盒購自國外某公司；其它試劑為國內生產的分析純試劑。

1-5 引物設計與合成利用Primer Premier5.0軟件，根據Genbank中注冊的MS 16SrRNA片段基因序列，設計合成多對引物，經過反復篩選出一對特異性引物MS-F/MS-R（MS-F：5’-CAGGCCGTCAAGGTCTTGTTC--3’；MSR2：5’- ACCGGCACAGCTATCCTCCTT-3’），跨度500bp。引物由國內一公司合成，引物使用終濃度為20nmoles/mL，-20℃狀態保存。

2 方法

2-1 雞滑液囊支原體的分離和鑒定

2-1-1 樣品的收集與處理

收集廣東地區雞群的疑患MS感染雞群的氣管、支氣管、肺、腿關節組織和分泌物，加入MS培養基中，37℃培養數天，直至培養基變黃。

2-2 雞毒支原體單菌落的挑取

無菌抽取少量已經變黃的培養液進行雜菌污染檢查，在確定培養液無雜菌生長之后，將變黃可疑培養物在相同的培養基中連續傳代3～5 代，然后取0.2mL培養物，接種于支原體固體培養基中，在37℃ 厭氧環境下培養7～15天。待肉眼可視菌落大小后，置于倒置10×10低倍顯微鏡下觀察菌落形態，并用滅菌注射器針頭挑取典型單菌落于2mL 液體培養基中，進行傳代培養和鑒定。

2-3 雞毒支原體菌落形態觀察

將分離純化培養的待鑒定的雞毒支原體培養物0.2mL接種于固體培養基中，37℃ 厭氧培養7～10d 后，置于低倍鏡下觀察菌落形態。

2-4 雞毒支原體姬姆薩染色鏡檢

將純化培養后待檢雞毒支原體培養液5mL，以3000rpm離心10min,用 PBS（pH6.8）按1/20 比例稀釋姬姆薩染色液，染色3h。

2-5 臨床菌株的分子生物學鑒定

按照愛思進公司的DNA提取試劑盒說明書提取MS的DNA。按照PCR擴增試劑盒說明，在24.4μL反應體系中，加入 RNAfree 水 16.6μL，5×PCR buffer5μL,酶 0.2μL，cDNA2μL,P1和P2各0.3μL。擴增參數為：經過94℃ 3秒后，94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s，循環30次。再在72℃延伸10 min。擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

圖1 a臨床第1株在固體培養基上培養10天后菌落（10×10）

2-6 動物回歸實驗

病雞關節炎滲出物接種于18天齡SPF雞胚卵黃囊，孵育7天后，收集卵黃液，以腳墊注射的方式按0.2ml/只用量，接種10日齡SPF雞，每天觀察并記錄雞只變化情況。

2-7 臨床株對常用抗菌藥物的敏感性測定

2-7-1 抗菌藥原液的配制

圖2

根據藥物的推薦治療量，將各抗菌藥物配制成濃度為128倍治療量的原液。氟喹諾酮類分別用無菌5%醋酸溶解后，用滅菌去離子水定容；氟苯尼考用無水乙醇溶解后，用pH6.0滅菌PBS定容；泰樂菌素用pH6.0滅菌PBS溶解、定容；強力霉素用pH4.5 滅菌PBS溶解、定容；采用細菌過濾除菌，分裝，-20oC冰箱保存備用。

2-7-2 最小抑菌濃度的測定

首先測定各株臨床菌的顏色變化單位（CCU），參照Hannan 推薦的標準，臨用前將各菌株稀釋至105。在96孔細胞板中,第1列每孔加180uL稀釋的菌液，其余各管中加入100uL菌液，將20umL藥液加入每列的第一孔中，充分吹打均勻后，取100uL加入第二管，以此類推，最后吸出100uL菌液棄去。每種藥液做兩個重復，最后兩列不加抗生素作空白對照37oC培養6～10d，每日觀察記錄結果。以抑制MG生長的抗生素的最高稀釋度作為最小抑菌濃度。

3 結果

3-1 臨床雞滑液囊支原體的分離、鑒定

3-1-1 雞滑液囊支原體菌落形態觀察

分離純化的可疑菌株在液體培養基中生長呈清亮黃色，輕輕振蕩，有沙粒樣菌體懸浮。在固體培養基上培養7～10d后，有些菌株用肉眼觀察，可見針尖大小、無色透明、圓潤、邊緣光滑的菌落。置低倍鏡（10×10）下觀察，可見菌落為無色透明，多數呈典型的“油煎蛋狀”，即菌落中央厚碩隆起。能觀察到支原體的出芽和裂殖兩種增殖方式。（見圖1）

3-1-2 雞滑液囊支原體姬姆薩染色鏡檢

分離純化后的雞滑液囊支原體經姬姆薩染色后，在（100×10）顯微鏡下鏡檢，菌體主要呈現藍紫色球狀，有少量呈細短桿狀或弧狀。

3-1-3 分子生物學鑒定

應用所設計的引物對MS分離株的核酸進行PCR擴增，結果擴增出一條為約500bp左右的目的片斷，與設計結果完全相符。（見圖2）

3-1-4 動物回歸試驗

病雞關節炎滲出物接種于18天齡SPF雞胚卵黃囊，孵育7天后，收集卵黃液，以腳墊注射的方式接種10日齡SPF雞（0.2ml/只），每天觀察雞只變化情況。接種后7天左右，雞群出現與MS臨床感染相同的典型臨床癥狀，主要表現為臥地、陂行、關節腫脹，解剖可見雞只關節內有黏液滲出物，部分雞只關節內有干酪樣滲出物。

3-2 抗菌藥物敏感性實驗結果

表1 9種抗菌藥物對7株雞滑液囊支原體的最小抑菌濃度

采用試管二倍稀釋法測定了常用抗菌藥物對7株雞滑液支原體的最小抑菌濃度。結果見表1。

4 討論

4-1 雞滑液囊支原體感染多發于春夏季、潮濕季節或衛生條件、飼養管理不善，主要侵襲雛雞，特別是肉雛雞，常與新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒等呼吸道病原混合感染引起氣囊炎，有時可引起全身性感染并導致傳染性滑膜炎，給臨床確診帶來巨大的困難。

目前MS感染的確診方法主要有電鏡法、分離培養法、分子生物學方法以及血清學方法；其中，血清學方法由于經常會出現非特異性的交叉反應，因而在一定程度上會影響診斷的準確性；其次，分離培養法由于支原體對所需條件要求苛刻，培養時間長并且操作也相當的繁雜。相比之下，PCR法方法顯得快速簡單，并且其敏感性也遠遠高于前兩種方法，可臨床應用于MS感染的早期診斷和檢疫，但技術條件要求較高，在檢測時常由于抑制劑的干擾等因素而可能出現假陽性反應，因此最終確診需要多種檢測方法聯合使用。本研究通過菌落形態觀察、菌體形態觀察、PCR診斷、動物回歸試驗，成功建立了MS分離鑒定方法，并在病料中分離出7株MS臨床株，為后續研究工作奠定了堅實的基礎。

4-2 雞支原體感染在養雞業中非常普遍，預防和治療該病主要應用抗菌藥物，其中應用最為廣泛的藥物是林可霉素、泰樂菌素、紅霉素、喹諾酮類和氨基糖苷類等藥物，但隨著臨床抗菌藥物的大量使用和不合理使用，導致耐藥菌株的出現，造成治療效果不佳或病情反復的現象。從本次研究的藥敏結果可看出，臨床株對受試的9種抗菌藥物的敏感性不一，各臨床株對替米考星的敏感性差異最大（4.19倍治療量～67倍治療量），同時，在同一地區不同時間不同養戶分離的毒株對替米考星的敏感性的差異較顯著，替米考星對第1分離株的最小抑菌濃度是67倍治療量，而對第2分離株的最小抑菌濃度是4.19倍治療量，說明不同地方的用藥情況不一，同一地區不同時間不同養戶的用藥歷史、病情長短不一，導致各臨床株對同一種藥物的敏感性差異較大；9種抗菌藥物中，強力霉素對MS分離株的抑制效果最明顯，最小抑菌濃度均小于1，其次是氧氟沙星和利高霉素，兩種抗菌藥物對MS的抑制效果均較為理想，因此，在臨床上可嘗試參考用該類藥物進行防控MS感染。

[1] 雞滑液囊支原體的分離與鑒定[J].中國家禽，1998.