短時受精結(jié)合早期補救ICSI技術(shù)的臨床應(yīng)用

韓樹標(biāo)，韓偉，黃國寧

（重慶市婦幼保健院，重慶 400013）

以體外受精－胚胎移植（IVF-ET）為代表的人類輔助生殖技術(shù)為廣大不育不孕患者提供了生育自己孩子的可能。但是在目前的IVF中仍有約1%～10%的病例會發(fā)生受精完全失敗［1］。IVF受精失敗不僅僅影響輔助生殖技術(shù)的成功率，同時也給患者帶來巨大的心理及經(jīng)濟壓力。目前IVF實驗室針對不明原因不育或者其他可能存在受精失敗的患者，一般采取IVF和卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）分半（Half-ICSI），或者短時受精結(jié)合早期補救ICSI（即授精后5～6h補救ICSI）等措施來避免完全受精失敗的出現(xiàn)。在這些措施中應(yīng)用較多的是短時受精結(jié)合早期補救ICSI方法，獲得了較好的成功率，挽救了部分受精失敗的周期。本文主要從短時受精對臨床結(jié)局的影響、卵母細(xì)胞受精失敗的判斷、實施早期補救ICSI的時機等影響補救ICSI臨床治療成功率方面探討補救ICSI技術(shù)在人類輔助生殖技術(shù)的臨床應(yīng)用。

一、短時受精對臨床結(jié)局的影響

實施補救ICSI的前提是短時受精，即授精后早期拆除顆粒細(xì)胞觀察是否受精，以便于挽救受精失敗的周期。但是與常規(guī)受精相比，短時受精的受精率以及對胚胎發(fā)育的影響有待進一步驗證。

首先，哺乳動物自然受精是一個嚴(yán)格有序的生理過程，主要包括：精卵識別、精子發(fā)生頂體反應(yīng)并穿過透明帶、精子與卵子質(zhì)膜融合、卵子皮質(zhì)反應(yīng)與多精入卵的阻止以及雌雄原核的形成融合并最終啟動卵裂［2］。根據(jù)這一生理過程，早期人類輔助生殖技術(shù)中一般采用精卵共培養(yǎng)16～18h后，然后拆除顆粒細(xì)胞觀察是否受精，又稱為常規(guī)受精。常規(guī)受精作為一種傳統(tǒng)的受精方式，由于操作簡便一直為大多數(shù)生殖中心采用。但Gianaroli等［3］的研究表明，長時間的精卵共孵育可能會產(chǎn)生高的活性氧（ROS）影響胚胎質(zhì)量。同時，胚胎暴露于ROS環(huán)境中可能會導(dǎo)致透明帶的硬化，而損傷胚胎的種植潛能［4］。Gianaroli等［5］研究表明，精卵共孵育4h與15min相比，穿過顆粒細(xì)胞層抵達卵母細(xì)胞周圍的精子數(shù)量并無顯著增加。這些結(jié)果表明，受精過程中長時間的精卵共孵育可能是沒必要的，同時還會影響胚胎質(zhì)量。

其次，相對于常規(guī)受精，短時受精更符合人體的自然受精過程。正常的人類精卵相互作用和受精發(fā)生在性交后20min內(nèi)，完成精卵結(jié)合、精子穿過透明帶、開始受精、皮質(zhì)反應(yīng)以及透明帶硬化等一系列生理事件。在自然受精過程中，雖然一次性交會射出大量精子，但僅有極少數(shù)精子可以抵達卵母細(xì)胞，只有一個精子進入卵母細(xì)胞完成受精。短時受精后胚胎脫離精子移入新的培養(yǎng)環(huán)境中，更符合正常受精后胚胎周圍的微環(huán)境。Suresh等［6］研究表明，與過夜受精相比精卵共孵育2h受精可顯著提高胚胎質(zhì)量、臨床妊娠率以及胚胎種植率。張寧媛等［7］通過自身對照的方式研究短時受精與常規(guī)過夜受精對受精結(jié)局的影響，結(jié)果表明，3h精卵共孵育不影響受精結(jié)局。Xiong等［8］2011年的研究表明，與20h組相比，精卵共孵育6h不影響正常受精率和臨床結(jié)局。2013年Zhang等［9］對近幾年的文章進行系統(tǒng)薈萃分析，結(jié)果提示，與常規(guī)受精相比，短時受精可以提高臨床妊娠率和胚胎種植率。綜上，短時受精可以與常規(guī)受精一樣安全有效地應(yīng)用于人類輔助生殖技術(shù)。

二、受精失敗判斷及早期補救ICSI

受精失敗的判斷是實施早期補救ICSI的關(guān)鍵步驟，因為只有在早期對卵母細(xì)胞受精與否進行精確判斷，才可以實施早期補救ICSI。在常規(guī)IVF受精過程中，受精的判斷是在加精后20h左右，雌雄原核形成后，主要根據(jù)雌雄原核的個數(shù)結(jié)合第二極體情況，判斷是否受精。

短時受精與否的判斷標(biāo)準(zhǔn)是第二極體的排出，第二極體的判斷主要受實驗室胚胎技術(shù)人員的經(jīng)驗等的影響（圖1）。

圖1 短時受精后第二極體排出情況

其次，受精后的觀察時機也是影響第二極體觀察的最重要因素。Van den Bergh等［10］研究表明，受精后2h有56．6%的卵母細(xì)胞排出第二極體，到了3h第二極體的排出率將增加到78．3%。南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院對常規(guī)IVF受精的正常受精周期，回顧性分析第二極體排出時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)授精后3h即有78．7%的卵母細(xì)胞排出第二極體，到了6h第二極體的排出比率可以增加到92．9%［11］。提示成熟度適當(dāng)?shù)穆涯讣?xì)胞如果受精，在6h應(yīng)該排出第二極體。因此，早期受精判斷為完全受精失敗是有依據(jù)的。

一旦受精失敗，患者將可能由于沒有可移植胚胎而被迫取消周期，將給患者帶來巨大的心理及經(jīng)濟壓力，同時也增加了臨床醫(yī)生的壓力。2003年Chen等［12］率先提出早期補救的理念并應(yīng)用于臨床治療，將補救ICSI的時間定在加精后6h，通過對第二極體排出作為早期判斷受精與否的標(biāo)準(zhǔn)，對無第二極體的卵母細(xì)胞實施補救。結(jié)果表明，補救后受精率及臨床結(jié)局均有顯著提高。南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院2006～2008年的早期補救ICSI新鮮胚胎移植周期的妊娠率為57．3%［11］。顯而易見早期補救ICSI技術(shù)可以作為受精失敗的補救措施。

三、補救ICSI時機

目前一般是在授精后5～6h實施早期補救ICSI。Sirard等［13］的研究表明，授精5h后，大部分卵母細(xì)胞已經(jīng)趨于老化，錯過了受精的最佳時機，雖然此時實施補救ICSI不會影響雌雄原核的形成，但是維持胚胎正常分裂的一些細(xì)胞因子或mRNA發(fā)生了降解或修飾，從而失去了原有功能，而影響胚胎的發(fā)育速度和質(zhì)量，甚至?xí)绊懪咛サ陌l(fā)育潛能。我們中心的數(shù)據(jù)也顯示，實施補救ICSI的時機與臨床結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，即補救ICSI時機越早，其臨床結(jié)局越好［14］。因此，在可能的條件下，應(yīng)盡量提前對確定不受精的卵母細(xì)胞實施補救ICSI。

綜上所述，對于可能存在受精失敗的周期，采用短時受精不影響其卵母細(xì)胞正常受精，且可通過早期觀察，判斷受精是否成功。為受精失敗的周期實施早期補救ICSI，可挽救部分由于受精失敗而導(dǎo)致取消的周期。

［1］ Mahutte NG，Arici A．Failed fertilization：is it predictable？［J］．Curr Opin Obstet Gynecol，15：211-218．

［2］ 陳大元 主編 ．受精生物學(xué)［M］．北京：科學(xué)出版社，2000：170-174．

［3］ Gianaroli L，Magli MC，F(xiàn)erraretti A，et al．Reducing the time of sperm-oocyte interaction in human in vitro fertilization improve the implantation rates［J］．Hum Reprod，1996，11：166-171．

［4］ Dirnfeld M，Shiloh H，Bider D，et al．A prospective randomized controlled study of the effect of short coincubation of gametes during insemination on zona pellucida thickness［J］．Gynecol Endorinol，2003，17：397-403．

［5］ Gianaroli L，F(xiàn)iorentino A，Magli MC，et al．Prolonged spermoocyte exposure and high sperm concentration affect human embryo viability and pregnancy rate［J］．Hum Reprod，1996，11：2507-2511．

［6］ Kattera S，Chen C．Short coincubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates：a prospective，randomized，controlled study［J］．Fertil Steril，2003；80：1017-1021．

［7］ 張寧媛，孫海翔，胡婭莉，等 ．短時受精聯(lián)合早期補救性卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射在完全受精失敗周期的臨床應(yīng)用［J］．中華男科學(xué)雜志，2009，15：538-541．

［8］ Xiong S，Han W，Liu JX，et al．Effects of cumulus cells removal after 6hco-incubation of gametes on the outcomes of human IVF［J］．J Assist Reprod Genet，2011，28：1205-1211．

［9］ Zhang XD，Liu JX，Liu WW，et al．Time of insemination culture and outcomes of in vitro fertilization：a systematic review and meta-analysis［J］．Hum Reprod Update，2013，19：685-695．

［10］ Van den Bergh M，Bertrand E，Englert Y．Second polar body extrusion is highly predictive for oocyte fertilization as soon as 3hr after intracytoplasmic sperm injection（ICSI）［J］．J Assist Reprod Genet，1995，12：258-262．

［11］ 黃國寧，孫海翔 ．體外受精－胚胎移植實驗室技術(shù)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：95-115，163-175．

［12］ Chen C，Kattera S．Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6hpost-insemination in conventional IVF［J］．Hum Reprod，2003，18：2118-2121．

［13］ Sirard MA，Richard F，Blondin P，et a1．Contribution of the oocyte to embryo Quality［J］．Theriogenology，2006，65：126-136．

［14］ Liu W，Liu J，Zhang X，et al．Short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI：an optimal strategy for complete fertilization failure after IVF［J］．Hum Fertil（Camb），2013，available online on December 6，［Epub ahead of print］．