復方鹿角霜對膠原誘導性關節炎模型小鼠抗炎作用研究*

陳臘霞,王燕燕,孫偉光,許鑫

(1.三峽大學第一臨床醫學院,宜昌 443002;2.湖北省宜昌市中心人民醫院藥劑科,宜昌 443002;3.華中科技大學同濟醫學院藥學院,武漢 430030;4.湖北中醫藥大學,武漢 430065)

復方鹿角霜對膠原誘導性關節炎模型小鼠抗炎作用研究*

陳臘霞1,王燕燕2,孫偉光3,許鑫4

(1.三峽大學第一臨床醫學院,宜昌 443002;2.湖北省宜昌市中心人民醫院藥劑科,宜昌 443002;3.華中科技大學同濟醫學院藥學院,武漢 430030;4.湖北中醫藥大學,武漢 430065)

目的 觀察復方鹿角霜對小鼠膠原誘導性關節炎(CIA)體內相關炎癥細胞因子的表達及滑膜組織病理學的影響。方法建立小鼠CIA模型,實驗小鼠隨機分為5組:空白對照組,模型對照組,復方鹿角霜總膏低、高劑量組(C1,C2組),雷公藤多苷片組。小鼠第一次免疫后,觀察小鼠的一般情況,記錄小鼠前后足爪病變發生情況。小鼠第二次免疫后,復方鹿角霜C1、C2組分別灌胃給予復方鹿角霜總膏2.5,5 g·kg-1·d-1,雷公藤多苷片組灌胃給予雷公藤多苷片13.6 g·kg-1·d-1,連續4周。小鼠給藥結束后,取血分離血清,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測小鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-4(IL-4)的表達水平。取小鼠足踝關節,光鏡觀察關節滑膜組織病理學變化。結果與模型對照組比較,復方鹿角霜C1、C2組、雷公藤多苷片組血清TNF-α均明顯降低;而復方鹿角霜組血清IL-4水平升高。模型對照組關節病理可見滑膜組織增生,各給藥組關節病理形態有所改善。結論復方鹿角霜可減輕膠原誘發的小鼠關節炎紅腫癥狀,其作用機制可能與降低炎性因子TNF-α、調節抑炎因子IL-4作用有關。

鹿角霜,復方;關節炎;膠原,Ⅱ型;細胞因子

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是目前嚴重危害人類健康的自身免疫性疾病,其病因尚不明確,可能與遺傳、環境及感染等因素相關。中醫將類風濕關節炎歸屬于痹癥,患者多因體虛與濕熱、淤血互結,導致類風濕臨床癥狀的產生。《金匱要略》認為營衛不和是類風濕關節炎常見病機,營衛氣血即中醫免疫系統,調和營衛法被廣泛的用于治療類風濕關節炎。同時現代免疫學認為,RA屬于炎癥性自身免疫性疾病,而以細胞因子為靶點的免疫治療,已成為RA疾病治療切入點。復方鹿角霜處方為宜昌市中心人民醫院經驗方,來源于臨床有效方劑鹿角霜抗風濕復方,而其抗炎作用機制尚不明確。筆者在本實驗中探討復方鹿角霜對膠原誘導性小鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin, IL)-4及關節組織的影響,明確其可能的抗炎作用機制,為研究復方鹿角霜的治療作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 6～8周齡SPF級Balb/c小鼠,雄性,體質量(18±2)g,由湖北省疾病控制中心提供,合格證號: SCXK2008-0005。動物飼養在SPF級動物房,環境溫度(22±2)℃,相對濕度(55±5)%,12 h光暗循環。所有實驗均嚴格按照實驗動物有關條例進行。

1.2 試劑 復方鹿角霜(華中科技大學同濟醫學院藥學院研究室提取制備),雷公藤多苷片(上海復旦復華藥業有限公司,批號:Z31020415),羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司,批號:F20101222),牛Ⅱ型膠原(Sigma公司,批號:C7806),完全弗氏佐劑(Sigma公司,批號:F5881);不完全弗氏佐劑(Sigma公司,批號: F5506);TNF-α酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司,批號:EK0527);IL-4 ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司,批號:EK0405)。

1.3 主要儀器 電子天平(沈陽龍騰電子有限公司),高速離心機(TG16A-WS),加樣器(Eppendorf research,1 000,200,10 μL),光學顯微鏡(Olympus, BH-2,Japan),-20℃低溫冰箱(SIEMENS)。

1.4 動物分組 小鼠適應性喂養3～5 d,通過隨機數字表法,將小鼠分為空白對照組、膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis,CIA)模型對照組、復方鹿角霜低劑量組(C1組)、復方鹿角霜高劑量組(C2組)、雷公藤多苷片組共5組,每組10只。

1.5 藥物的制備 中藥鹿角霜抗風濕復方提取物:取鹿角霜、蜂房、鹿銜草、忍冬藤、桑枝、桂枝藥材,12倍水浸泡藥材1 h,煎煮2次,每次3 h。經減壓濃縮、真空干燥、粉碎,過篩孔內徑0.180 mm(80目)篩,即得復方鹿角霜提取物,本品呈棕灰色粉末狀。雷公藤多苷片劑,研磨成粉末狀。0.5%羧甲基纖維素鈉混懸,得藥物混懸液。

1.6 造模 4組Balb/c雄性小鼠[1-2],造模,隨機留1組作為空白對照組。造模前1 d,將牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol·L-1的醋酸溶液中,終濃度2 mg·mL-1,置于4℃冰箱中過夜備用。將溶解的牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等體積混合,低溫條件下充分乳化。將乳化完全的乳滴于Balb/c小鼠尾根部皮內注射100 μL,進行初次免疫,造模當天記為實驗第1天。第21天將牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑等體積混合,用同樣的方法進行第2次免疫[3-5]。空白對照組給予0.9%氯化鈉溶液進行免疫。小鼠關節出現紅、腫表現或畸形即為實驗造模成功[6-7]。

1.7 給藥方法 第2次免疫完成后,第22天小鼠開始灌胃給藥。空白對照組和模型對照組給與等體積0.5%羧甲基纖維素鈉;C1組和C2組分別給予復方鹿角霜250,500 mg·mL-1,雷公藤多苷片組給予1.36 mg·mL-1雷公藤多苷片。灌胃前混懸均勻,小鼠灌胃量按0.1 mL·(10 g)-1給藥,連續灌胃4周。

1.8 指標檢測 最后一次給藥結束后,小鼠摘取眼球取血,取血量約1.0 mL。血液室溫靜置1 h, 3 000 r·min-1離心10 min。取上層血清,分裝于EP管中,置-20℃冰箱中儲存備用。ELISA測定血清TNF-α、IL-4水平,嚴格按照試劑盒操作步驟進行。

1.9 小鼠后踝關節病理學觀察 實驗結束后,小鼠脫臼處死,剝離切取各組右側踝關節,立即放入10%甲醛溶液中。常規脫水,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅染色。光學顯微鏡下觀察關節組織的病理變化,主要從滑膜細胞增殖、炎癥和骨質侵蝕等方面進行觀察。

1.10 統計學方法 實驗數據采用SPSS18.0版軟件進行分析,以均數±標準差(±s)表示。多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠大體情況變化 小鼠第1次免疫后,空白對照組小鼠尾根部紅腫很快恢復正常;模型對照組小鼠尾根部表現紅腫,有些出現明顯的潰爛,直至實驗結束時仍無好轉。

2.2 小鼠前后足爪病變情況 第30天小鼠足爪開始出現紅腫,有的表現為足趾紅腫,有的表現為足掌紅腫。小鼠足爪腫脹一直存在,持續至實驗結束。說明牛Ⅱ型膠原誘導的關節炎造模成功,可以為本實驗評價復方鹿角霜對CIA模型的治療作用提供參考。

2.3 復方鹿角霜對小鼠血清TNF-α和IL-4的影響與模型對照組比較,C1組、C2組小鼠血清TNF-α明顯降低(P＜0.01);C1組小鼠血清中IL-4水平含量增加(P＜0.01),C2組IL-4水平含量有增加的趨勢,但差異無統計學意義。見表1。

表1 5組小鼠血清TNF-α、IL-4比較Tab.1 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-4 in five groups of mice

2.4 關節組織結構的變化 空白對照組小鼠關節軟骨表面光滑平整,無炎性細胞浸潤,如圖1A所示;模型對照組小鼠滑膜組織明顯增厚,滑膜內血管豐富,如圖1B所示;而各給藥組小鼠滑膜細胞增生、血管炎表現在一定程度上減輕,如圖1C、D、E所示。見圖1。

3 討論

RA屬中醫“痹癥”范疇,正氣不足是類風濕關節炎發病的根本,邪氣入侵是類風濕關節炎的發病條件,基本病機是素體本虛,氣血不足,肝腎虧損,風寒濕邪痹阻脈絡[8]。RA病因及發病機制尚不明確,但病理改變的靶器官以關節滑膜為主,同時伴隨著全身免疫系統的活化。復方鹿角霜處方是醫院經驗方,來源于臨床有效方劑鹿角霜抗風濕復方,由鹿角霜、蜂房、鹿銜草、忍冬藤、桑枝、桂枝6味藥組成。以鹿角霜為君,補腎助陽,活血通脈;以鹿銜草、忍冬藤為臣,強筋健骨,祛風除濕,疏利關節;以蜂房為佐,祛風止痛;以桑枝、桂枝為使,氣血通融,邪去正復。因而,如何借助現代藥理實驗,明確鹿角霜抗風濕復方治療RA活性及作用機制,尋找和開發新的防治RA的藥物成為極待進一步研究的問題。研究表明,TNF-α促進血管內皮細胞表達黏附分子;趨使炎性細胞聚集于關節滑膜處;誘導軟骨、成纖維細胞合成和分泌膠原酶、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等炎癥遞質;介導滑膜炎癥和軟骨破壞[9-11]。IL-4是一種具有多生物學效應的細胞因子,其抑炎作用主要通過以下途徑:調節多種RA不同類型細胞活性,從而抑制TNF-α、IL-6等致炎因子的產生,同時也可抑制PGE2的表達,控制炎癥的發生和發展;IL-4還可協同IL-10的抗炎作用[12-13]。通過對小鼠足趾和尾根部觀察,成功建立了小鼠膠原誘導性關節炎模型。結果發現,在治療實驗中,用乳化完全的乳滴對Balb/c小鼠尾根部進行兩次皮內注射,可以制作穩定的小鼠關節炎模型。ELISA法結果顯示,模型對照組血清TNF-α含量上升,IL-4含量下降。表明炎性因子TNF-α和IL-4參與了膠原誘導性關節炎的發生過程,與文獻報道一致。而復方鹿角霜治療后,各治療組血清TNF-α含量明顯少于模型對照組,說明復方鹿角霜可抑制膠原誘導的關節炎小鼠血清TNF-α的表達。復方鹿角霜組小鼠血清IL-4水平高于模型對照組,但高劑量組有升高趨勢,差異無統計學意義。病理結果顯示:模型對照組滑膜組織增生明顯、炎性細胞浸潤;復方鹿角霜治療后,滑膜組織增生輕于模型對照組。表明復方鹿角霜可抑制小鼠膠原誘導的關節炎癥反應。由此可見,復方鹿角霜減輕小鼠膠原誘導的關節炎可能與調節小鼠血清TNF-α和IL-4表達有關。

A.空白對照組;B.模型對照組;C.C1組;D.C2組;E.雷公藤多苷片組圖1 光鏡下5組小鼠關節組織的結構變化(HE,×100)A.blank control group;B.model control group;C.group C1;D.group C2;E.glucosidorum tripterygll totorum groupFig.1 Pathological changes of articular tissues in five groups of mice by light microscope(HE,×100)

參考文獻

[1] 周茹,楊以阜,左建平.Ⅱ型膠原誘導的小鼠關節炎動物模型的建立及影響因素[J].中國藥理學通報,2006,22 (12):1532-1535.

[2] JOE B,WILDER R L.Animal models of rheumatoid arthritis [J].Mol Med Today,1999,5(8):367-369.

[3] 肖智勇,張令令,張小銳,等.小鼠膠原誘導性關節炎模型的建立及其免疫學變化研究[J].中國比較醫學雜志, 2011,21(10):136-140.

[4] TRENTHAM D E,TOWNES A S,KANG A H.Autoimmunity to type II collagen:an experimental model of arthritis [J].J Exp Med,1977,146(3):857-868.

[5] BRANG D D,LATHAM K A,ROSLONIEC E F.Collageninduced arthritis[J].Nat Protoc,2007,2(5):1269-1275.

[6] 張玲玲,劉云潔,童彤,等.DBA/1小鼠膠原性關節炎模型建立方法及評價指標[J].中國藥理學通報,2010,26 (8):1108-1111.

[7] 宋珊珊,張玲玲,魏偉.實驗性關節炎動物模型建立及病理機制研究進展[J].中國藥理學通報,2011,27(12): 1648-1653.

[8] 陳艷鳳,孫素平.中醫辨治類風濕關節炎研究概況[J].實用中醫內科雜志,2011,25(10):60-61.

[9] 羅心靜,莫選榮,周玲玲.TNF-α誘導類風濕關節炎滑膜細胞NF-κB信號通路活化的探討[J].免疫學雜志, 2012,28(4):321-323.

[10] 馬武開,姚血明,黃穎,等.金烏健骨方對關節炎模型大鼠的抗炎作用研究[J].醫藥導報,2013,32(5):569-572.

[11] 胡清,曾玉琴,李雪鋒,等.小劑量生物制劑聯合甲氨蝶呤治療類風濕關節炎35例[J].醫藥導報,2012,31(8): 1026-1028.

[12] 范雪亮,肖金魚.關節炎大鼠模型血清中IL-4、IL-10表達的檢測[J].中國中醫急癥,2011,20(7):1102-1127.

[13] 繆建春,蔡威黔.天然藥物抗類風濕關節炎作用的研究進展[J].醫藥導報,2010,29(7):872-874.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.003

Anti-inflammatory Effect of Compound Cornu Cervi Degelatinatum on Collagen-induced Arthritis Model of Mice

CHEN La-xia1,WANG Yan-yan2,SUN Wei-guang3,XU Xin4
(1.The First College of Clinical Medical Science, China Three Gorges University,Yichang 443002,China;2.Department of Pharmacy,Yichang Central People's Hospital,Yichang 443002,China;3.School of Pharmacy,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;4.Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065, China)

Objective To investigate the effects of compound cornu cervi degelatinatum on the expression of related inflammatory cytokines and pathological changes of the synovium in mice with collagen-induced arthritis(CIA).MethodsThe CIA model of Balb/c mice was established.The mice were randomly divided into 5 groups:blank control group,model control group,low-dose group(C1),high-dose group(C2)and glucosidorum tripterygll totorum group D.After the first immunization in mice,we observed the general condition and lesions of the fore and hind jaws.After the second immunization, the mice in groups C1 and C2 were orally administered with compound cornu cervi degelatinatum at the doses of 2.5 and 5 g·kg-1body weight per day for 4 weeks,and meanwhile those in group D were administrated with glucosidorum tripterygll totorum at the dose of 13.6 mg·kg-1body weight per day.The serum of the mice was collected to detect the levels of TNF-α and IL-4 by ELISA.Ankle joints were harvested,and the pathological changes of synovial tissues were observed under light microscope.ResultsAs compared with the model control group,the level of TNF-α in the treatment groups was significantly decreased,while the level of IL-4 was elevated in group C1.Histological pathology of ankle joints demonstrated that the synovium of the CIA mice were hyperplastic and the synovial tissues were markedly ameliorated in treatment groups.ConclusionThe compound cornu cervi degelatinatum can relieve redness and swelling in mice with CIA.The mechanism may be related to the inhibition of pro-inflammatory cytokine TNF-α and regulation of anti-inflammatory cytokine IL-4.

Cornu cervi degelatinatum,compound;Arthritis;Collagen,typeⅡ;Cytokine

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)08-0988-04

2013-04-19

2013-12-03

*國家“重大新藥創制”科技重大專項項目(2011ZX09102-006-05)

陳臘霞(1986-),女,湖北監利人,藥師,碩士,研究方向:藥理學。電話:(0)18986774195,E-mail:chenlaxia103 @126.com。

王燕燕(1964-),女,湖北宜昌人,主任藥師,碩士生導師,博士,主要從事中藥藥效學、醫院藥學研究。電話:0717-6487741,E-mail:wangyy1001@163.com。