新型鉀通道開放劑（QO-58）在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

劉燦仿，祁金龍，張海林，賈慶忠

QO-58化合物是河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過高通量篩選發(fā)現(xiàn)一個(gè)結(jié)構(gòu)全新的鉀通道開放劑，對(duì)電壓依賴性M通道（KCNQ2／3通道）有良好開放活性。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示QO-58開放KCNQ213通道的 EC50為0.06μmol·L－1，優(yōu)于國外已上市的第一個(gè)抗癲癇KCNQ通道開放劑retigabine（EC50，0.43μmol·L－1）［1－2］。初步藥理毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該化合物對(duì)小鼠戊四唑誘發(fā)的癲癇和電刺激引發(fā)的驚厥均有較好的治療作用，對(duì)緩激肽誘導(dǎo)的炎性疼痛也有效［3］，且未見明顯毒性。QO-58為吡唑并［1，5-a］嘧啶酮類化合物，由于其結(jié)構(gòu)新穎，生物活性高，我們已經(jīng)申請(qǐng)了中國及美國專利保護(hù)［4－5］，繼續(xù)研究有望獲得一種具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗癲癇、鎮(zhèn)痛一類新藥。為了弄清楚該化合物在體內(nèi)的吸收、分布規(guī)律，并指導(dǎo)進(jìn)一步的藥理毒理學(xué)研究中動(dòng)物給藥劑量及方式，同時(shí)作為新藥臨床前研究的一部分，我們建立RP-HPLC法，對(duì)QO-58在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和器材 島津LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)：包括 LC-20AT二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A檢測器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-solution色譜工作站。Eppendorf centrifuge 5417R型高速離心機(jī)。

1.1.2 主要試劑［6］QO-58結(jié)晶高純品由河北醫(yī)科大學(xué)新藥開發(fā)研究室提供（批號(hào)：2010003），純度為99.5%；色譜純乙腈和甲醇由德國Merck（Honeywell）公司提供；聚氧乙烯蓖麻油為注射級(jí)（Cremophor ELP），由河北醫(yī)科大學(xué)藥廠提供；尼群地平標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品鑒定所提供（批號(hào)：100585-200602）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年的清潔級(jí)SD大鼠，共24只，♀♂各半，體質(zhì)量220～250 g，購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：110305。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 灌胃用QO-58溶液 取QO-58原料藥適量，用適量溶劑（N，N-二甲基乙酰胺 ∶聚氧乙烯蓖麻油＝1∶9）溶解，得到備用溶液。

1.2.2 色譜條件［7］色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；乙腈 ∶0.2 mol·L－1乙酸銨 ＝43∶57等度洗脫；流速 1 ml·min－1；檢測波長285 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μl。

1.2.3 給藥與血漿樣品采集 大鼠禁食12 h，取“1.2.1”所配 QO-58溶液按25、50、100 mg·kg－1劑量灌胃，分別于給藥后 0.5、1、2、4、6、9、12、18、24、36、48、72 h由眼眶靜脈叢取血0.5 ml，收集于肝素化的離心管內(nèi)，4 000 r·min－1離心 10 min，分離出血漿并于－20℃凍存待測。

為計(jì)算灌胃不同劑量的QO-58的絕對(duì)生物利用度，按15 mg·kg－1大鼠尾靜脈注射給予QO-58溶液，于給藥后 0.083、0.167、0.333、0.666、1、1.5、2、3、4、8、12、24 h由眼眶靜脈取血0.5 ml，處理過程同上。另取同批次大鼠6只，制備空白血漿。

1.2.4 血漿樣品處理 取大鼠血漿200μl，加入內(nèi)標(biāo)尼群地平的乙腈溶液（220 mg·L－1）30μl，加入乙腈 800μl，渦旋混勻，12 000 r·min－1離心 10 min，取上清液900μl，室溫氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00μl乙腈溶解，超聲處理5 min，12 000 r·min－1離心 10 min，取上清20μl進(jìn)樣分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 將所得血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)用藥動(dòng)學(xué)軟件DAS2.1.1版軟件處理進(jìn)行擬合，求算QO-58在大鼠體內(nèi)經(jīng)灌胃給藥和靜脈給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 方法的專屬性 取大鼠空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按照“1.2.4”項(xiàng)下方法處理并分析，獲得空白樣品的色譜圖（Fig 1A）；將規(guī)定濃度的QO-58標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入大鼠空白血漿，獲得模擬生物樣本色譜圖。QO-58的保留時(shí)間7.8 min，內(nèi)標(biāo)尼群地平保留時(shí)間為10.0 min（Fig 1B）；取大鼠灌胃給藥后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖（Fig 1C），樣品峰和內(nèi)標(biāo)完全分離，且血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)不影響樣品的分離及測定。

Fig 1 HPLC chromatograms of QO-58 in rat plasma

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取空白血漿200μl，精密加入含計(jì)算量QO-58的等體積對(duì)照品貯備液，配制成質(zhì)量濃 度為0.1、0.5、2、5、10、20、40、160mg·L－1的樣品。按血漿樣品的處理項(xiàng)下方法依法操作，進(jìn)樣20μl，記錄色譜圖。以藥物的濃度為橫坐標(biāo)X，藥物和內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of QO-58 in four groups（ˉx±s）

在0.1～160 mg·L－1范圍內(nèi)，QO-58血漿藥物濃度與QO-58和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：Y＝0.0337X－0.0018，（r＝0.9989）。

2.3 最低定量限（LOQ） QO-58的檢測限、定量限分別在信噪比 S／N＝3和S／N＝10的標(biāo)準(zhǔn)下測定，該方法的定量限為0.1 mg·L－1，檢測限為0.025 mg·L－1。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度 制備低、中、高（0.3、20、160 mg·L－1）3種濃度的 QO-58的質(zhì)控（QC）樣品，每個(gè)濃度平行測定5份，連續(xù)測定5 d。日內(nèi)精密度RSD（n＝5）分別為 6.89%、4.06%、6.01%；日間精密度 RSD（n＝5）分別為 17.06%、5.69%、11.34%，準(zhǔn)確度RE%均小于20%，符合藥動(dòng)學(xué)研究要求［8］。

2.5 提取回收率實(shí)驗(yàn) 按“1.2.4血漿樣品處理”項(xiàng)下方法配制QO-58在血漿中的低、中、高3個(gè)濃度的QC樣品，以提取后的色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積之比，考察樣品的提取回收率。每一濃度進(jìn)行6樣本分析。3種濃度下提取平均回收率分別為89.56%、101.38%、99.42%，符合藥動(dòng)學(xué)研究要求。

2.6 穩(wěn)定性 按照前述血漿樣品處理方法制備低、中、高3種濃度的QO-58的QC血漿樣品各3份，測定濃度的平均值，分別考察在室溫放置2 h、4℃放置1周和－20℃放置18 d，及3次凍融循環(huán)處理后在室溫條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：低、中、高3個(gè)濃度血漿樣品濃度的RSD均小于9.38%，表明血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.7 QO-58在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué) 大鼠分別按照 25、50、100 g·kg－1劑量灌胃和 15 mg·kg－1劑量尾靜脈注射給予QO-58后，不同時(shí)間點(diǎn)取血測量得到血藥濃度數(shù)據(jù)。血藥濃度－時(shí)間曲線圖見Fig 2、3。DAS2.1.1版軟件擬合QO-58在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)均符合二室模型，處理所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見Tab 1。

Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of QO-58 after oral administration of 25 mg·kg－1，50 mg·kg－1 and 100 mg·kg－1 QO-58（n＝6）

Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of QO-58 after intravenous administration of 15 mg·kg－1 QO-58（n＝6）

大鼠灌胃 25、50、100 mg·kg－1劑量 QO-58與相對(duì)靜脈注射15 mg·kg－1劑量QO-58的絕對(duì)生物利用度分別為24.84%、26.49%、18.20%。

3 討論

血漿樣品中QO-58的含量測定采用乙腈直接沉淀蛋白，操作簡單、方便、回收率達(dá)到生物樣品分析要求。經(jīng)過流動(dòng)相配比及選擇后確定采用乙腈∶0.2 mol·L－1乙酸銨 ＝43∶57等度洗脫，不但可以獲得較短的保留時(shí)間，同時(shí)又可以與雜質(zhì)峰分離。QO-58經(jīng)紫外掃描，在285 nm處有最大吸收峰，且在此波長處內(nèi)標(biāo)尼群地平也有很強(qiáng)吸收，所以選擇285 nm作為色譜檢測紫外測定波長來測定QO-58含量。該方法具有靈敏、簡便、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可作為QO-58血藥濃度檢測的常規(guī)手段。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥具有重要的指導(dǎo)意義，QO-58的消除半衰期較長，特別是口服達(dá)到了8.24 h，Tmax大于4 h，提示該化合物吸收及代謝均較慢，因此可以適當(dāng)減少給藥次數(shù)。口服給藥劑量由 50 mg·kg－1提高到 100 mg·kg－1體重后Cmax未見明顯增大，且AUC0－t僅僅增大約37%左右，提示在50 mg·kg－1以后單純靠提高給藥劑量可能藥效學(xué)效果不佳。口服低、中、高3個(gè)劑量QO-58的生物利用度均相對(duì)較低，推測可能與QO-58在水中溶解度極低有關(guān)。總之，藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，該化合物起效較慢，藥效持續(xù)時(shí)間較長，在進(jìn)一步的臨床研究過程中我們需要通過化合物成鹽或者通過制劑等手段來改善其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

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