C-PC抑制ox-LDL誘導內皮細胞脂質過氧化損傷的機制研究

褚現明，王 妮，孫雪霞，李 冰，安 毅，徐慶科

氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是誘導動脈血管內皮細胞凋亡的重要因素［3］，內皮細胞保護是動脈粥樣硬化防治的關鍵環節［1－3］。研究提示天然海洋藥物——螺旋藻藻藍蛋白（C-Phycocyanin，C-PC）具有獨特的抗動脈粥樣硬化療效［4－5］，因此本研究旨在構建血管內皮細胞損傷模型，探討C-PC在血管內皮細胞脂質過氧化損傷中所起的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 藻藍蛋白由本課題組提取純化（純度為A620nm／A280nm＝4.71）［6］；♂Wista小鼠（100 g，4周齡）。LDL購自美國Chemicon公司。DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、SOD檢測試劑盒、N0檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、ET放射免疫藥盒（Sigma）。311型 CO2孵箱（Forma）；高速低溫冷凍離心機3K30型（美國PE）；紫外分光光度計（日本島津）。VIDAS計算機圖像分析系統，OLYMPUS倒置相差顯微鏡。

1.2 原代小鼠血管內皮細胞的培養 取小鼠胸主動脈，植塊法在含20%胎牛血清的DMEM培養液中培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和生長特征，免疫細胞化學方法進行血管內皮細胞Ⅷ因子相關抗原（von Willebrand factor，vWF）鑒定。試驗用2－4代細胞，細胞均處于對數生長期。

1.3 實驗分組和藥物干預 甲基四唑藍（MTT）比色法檢測細胞活性、篩選藥物劑量，選取低于10%的內皮細胞生長受抑制（IC10）的C-PC濃度進行藥物干預。分組：正常對照組、ox-LDL組、ox-LDL＋C-PC組。對數生長期的內皮細胞（2×107·L－1），接種于96孔板中，每孔 200μl。各組于37℃ 5%CO2孵箱內培養12 h。然后ox-LDL組、C-PC組用含有ox-LDL的培養液繼續培養，24 h后進行檢測。

1.4 ox-LDL誘導動脈內皮細胞脂質過氧化損傷和凋亡LDL氧化修飾和鑒定［7］，獲取ox-LDL用于誘導培養內皮細胞凋亡，25%的細胞生長受抑制所需要的ox-LDL濃度，約為20 mg·L－1。

1.5 單核細胞（HL60）黏附計數法測定內皮細胞黏附性 96孔板，內皮細胞接種并培養至融合，不同濃度的C-PC預孵12 h，然后加入終濃度為0.1 g·L－1的ox-LDL繼續培養24 h，傾去培養液。每孔加入109·L－1的 HL60細胞，37℃，2 h后洗去未黏附細胞，觀察并計算各組HL60黏附內皮細胞數。

1.6 ox-LDL誘導內皮細胞脂質過氧化損傷的指標測定 分別采用黃嘌呤氧化酶法、亞硝酸還原酶法、硫代巴比妥酸法、放射免疫法，測定細胞培養液中超氧化物歧化酶（SOD）活性、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量、內皮素（ET）含量。

1.7 統計學分析 用SPSS 17.0進行t檢驗、方差分析，數據以ˉx±s表示。

2 結果

2.1 ox-LDL誘導動脈內皮細胞凋亡 低于細胞生長抑制率≤10%（IC10）的 C-PC藥物濃度：C-PC＜80μmol·L－1。選取藥物干預濃度 20、40、60、80μmol·L－1。

正常內皮細胞為扁平多角形，細胞間連接致密，呈連續排列的單層，核圓形或橢圓形、清晰，核仁1～2個。ox-LDL損傷后，細胞收縮變圓，細胞間隙明顯增寬，部分細胞脫落。ox-LDL＋C-PC干預組形態異常和脫落細胞減少，最佳C-PC干預濃度為80μmol·L－1。

2.2 C-PC對培養的內皮細胞黏附性的影響（Tab 1） ox-LDL＋C-PC組黏附的HL60細胞數均較 ox-LDL組減少，80 μmol·L－1C-PC組的黏附數僅為ox-LDL組的59.4%（P＜0.01）。

Tab 1 Effect of C-PC on endothelial cell adhension（n＝6）

2.3 各組SOD活性、NO、MDA及ET含量的變化（Tab 2）ox-LDL組與正常對照組比較，細胞培養液中SOD活性、NO含量明顯降低、MDA、ET含量明顯升高。ox-LDL＋C-PC組80μmol·L－1與ox-LDL組相比，SOD活性、NO含量分別增加193%和203%，MDA、ET含量分別下降49%和74%。線性相關分析顯示SOD活性、NO含量與C-PC呈劑量正相關（r＝0.97，0.96，P＜0.01）；MDA、ET含量與 C-PC呈劑量負相關（r＝－0.908，－0.916，P＜0.05）。

3 討論

螺旋藻富含藻藍蛋白（C-PC），含量達60～70%。分離純化的C-PC具有水溶性、安全、無毒的特點［6］，研究表明，CPC具有調節血脂、抑制血管損傷后的平滑肌細胞的過度增殖、抗腫瘤增殖的作用［5，8］。

ox-LDL是內皮細胞損傷的關鍵因素之一，促進內皮細胞及單核細胞分泌黏附分子，使單核細胞易于黏附。內皮細胞所具有的抗氧化機制如SOD可清除活性氧，SOD活性降低，氧自由基生成增加，氧化細胞膜雙層磷脂結構中的重要脂類，生成多種脂質過氧化物，使得培養液中MDA含量增高，MDA為脂質過氧化反應的中間產物，常被作為觀察活性氧生成和膜損害的指標［9］。NO和ET的動態平衡，最終決定了血管的舒縮和平滑肌細胞的有絲分裂狀態。缺氧可使內皮細胞合成NO，而ET mRNA表達的增加；SOD可減輕ET對鼠骨骼肌缺血／再灌注損傷的加劇［9］。

本研究結果提示，C-PC抑制ox-LDL誘導內皮細胞脂質過氧化損傷，可能的機制：（1）提高SOD活性，減少活性氧生成，MDA生成減少；（2）使NO產生增多、減少ET生成，有助于改善血管舒張功能；（3）抑制脂質過氧化損傷，抑制單核細胞的黏附。但深入的機制研究有待明確，如可能與減低NO的氧化失活、激活eNOS、提高NO生物利用度、影響ETmRNA水平及轉錄有關，這還有待于進一步的深入研究。

參考文獻：

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Tab 2 Effect of C-PC on SOD、NO、MDA、ET in endothelial cell culture solution（n＝6）