前列地爾納米乳凍干工藝研究

冉海東，孫寧云，張軍東，李 娟＊，廉云飛，房秋雨

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.上海信誼藥廠有限公司，上海 201206）

前列地爾（alprostadil）是天然前列腺素類物質［1］。前列地爾具有廣泛的生物活性，在心腦血管疾病治療中有著廣泛應用［2－3］。前列地爾穩定性差，易水解。前列地爾納米乳是將前列地爾溶于注射用油后再分散于水相中而形成的納米乳注射液。前列地爾納米乳在生物體內不穩定［4－5］，常溫放置會發生分層、絮凝及降解等。將納米乳制成干乳劑能顯著提高其常溫放置穩定性，如丙泊酚干乳劑、紫杉醇干乳劑。本文采用冷凍干燥法［6］將前列地爾納米乳制成干乳劑，并考察了凍干保護劑種類和冷凍干燥工藝，旨在確定最佳凍干工藝，提高前列地爾納米乳穩定性。

1 儀器與材料

ZS90激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；東富龍LYO－13冷凍干燥機（上海東富龍科技股份有限公司）；IKAT25高速分散機（德國IKA公司）；S－3400N掃描電子顯微鏡、H600透射電鏡（株式會社日立制作所）；DSC204F1型差示掃描量熱儀（德國Netzsch公司）Ailgent 1100（美國安捷倫科技公司）；FB－110Q均質機（上海勵途機械設備有限公司）；卡爾費休水分測定儀ZKF－1（上海超精科技有限公司）。

前列地爾原藥（吉林英聯生物制藥股份有限公司，20120801）；卵磷脂（德國Lipoid公司，EL12021）；大豆油（鐵嶺北亞藥用有限公司，121102003）；油酸（上海東尚科技有限公司，520200）；甘油（汕頭紫光氨基酸有限公司，120516）海藻糖、麥芽糖（阿拉丁試劑公司，J1216051）甘露醇（藥用級，法國羅蓋特公司，E988G）；乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇（藥用級，國藥集團化學試劑有限公司）；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 前列地爾納米乳及凍干乳劑制備

按前列地爾納米乳制備方法制備納米乳液，滅菌罐裝后得前列地爾納米乳劑。將制得納米乳液加入凍干保護劑后分裝于10mL西林瓶中，每瓶裝量2mL；最終優化的凍干工藝為：將樣品放入－20℃冰箱預凍12h，然后放入凍干機，經－45℃快速預凍2h，抽真空0.34mbar；升溫至－35℃保持36h，繼續升溫至－10℃保持4h，升溫至15℃保持6h，無菌封裝后即得凍干樣品。

2.2 納米乳粒徑測定

將納米乳液稀釋5000倍，在25℃下，置于激光粒度儀的樣品池中，測定乳液的粒徑、多分散系數（凍干劑則加等量水復溶后再稀釋相同倍數進行粒徑測定）。如圖1，所制得的納米乳液平均粒徑和PDI分別為（164.7±21.9）nm、0.066。

圖1 前列地爾納米乳平均粒徑

2.3 納米乳中前列地爾含量及雜質測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為 Waters Symmetry C18色譜柱，以0.0067mol／L磷酸鹽緩沖液（pH為6.3）－乙腈（3∶1）為流動相；流速為1mL／min；柱后反應液為1mol／L氫氧化鉀溶液，柱后反應管為聚四氟乙烯管（φ0.5mm×10m）；柱溫60℃；檢測波長278nm。進樣量：20μL。

2.3.2 含量測定 精密量取前列地爾納米乳5mL，破乳后加1／1000磷酸定容，過預處理柱后用甲醇洗脫于蒸餾瓶中，減壓蒸干溶解進樣，以內標法計算得樣品含量為：99.5%；雜質A1為0.1μg／mL。凍干劑則加等量水復溶后再進行測定。

2.4 凍干保護劑初篩

凍干過程是個復雜的相變過程，耗時長，耗電量大。凍融試驗［7］是將樣品放至低溫冰箱進行預凍，而后置室溫溶解。凍融試驗耗時短，耗電量小，易篩選。因此本實驗采用凍融試驗進行保護劑初篩。

2.4.1 保護劑種類初篩 精密量取前列地爾納米乳8份，每份2mL。于乳劑中分別加入甘露醇、乳糖使糖濃度為5%（W／V）；加入山梨醇、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖使其濃度為10%（W／V）；另一份作為空白。輕輕振蕩乳液，待其完全溶解并混合均勻后放入－20℃冰箱中預凍12h。待其完全凍實，觀察外觀；復溶后測定其平均粒徑及PDI，比較與凍干前納米乳液粒徑區別。如表1所示，保護劑對凍干產品有明顯保護效果；在相同試驗條件下處方4、5、6、7平均粒徑較凍干前無顯著變化。因此初步篩選蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、海藻糖作為凍干保護劑。

表1 加入不同凍干保護劑凍融后平均粒徑及PDI

2.4.2 保護劑濃度初篩 精密量取前列地爾納米乳20份，每份2mL。于乳劑中分別加入蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、海藻糖，添加每種糖使其濃度分別為1%、5%、10%、15%、20%（W／V）；處理方法同“2.4.1”。結果顯示，1%和20%的糖預凍后粒徑變化明顯，因此初步選擇5%、10%、15%（W／V）四種糖濃度進一步篩選。

2.5 凍干保護劑優化

精密量取納米乳劑12份，每份2mL；于乳劑中分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖使其濃度分別為5%、10%、15%，輕輕振蕩乳液，待其完全溶解并混合均勻后放入－20℃冰箱中預凍12h；而后進行冷凍干燥61h，以凍干乳劑的外觀、復溶后外觀、平均粒徑、復溶速度為指標來篩選凍干保護劑種類及濃度（表2）。

表2 不同種類及濃度凍干保護劑對前列地爾凍干納米乳性質的影響

表2顯示，10%海藻糖加入后，凍干復溶速度較快，凍干后外觀平滑緊致，復溶后呈半透明狀且粒徑及PDI無顯著性變化。這可能與海藻糖的特殊空間結構有關：它的椅式和船式構象間轉變影響了干燥狀態下的磷脂膜結構，進而維持無水狀態時膜的穩定。同時通過調節其濃度能夠抑制冰晶的生長，降低其對乳滴的擠壓和機械損傷作用，保護乳滴的結構，從而達到非常好的凍干保護效果。因此篩選出最佳保護劑為10%海藻糖。

2.6 凍干工藝考察

冷凍干燥過程可分為預凍階段、第一階段干燥和第二階段干燥。其過程中影響凍干效果和產品質量的因素較多，下面分別對預凍溫度、速度、預凍時間以及干燥時間等因素分別進行考察。

2.6.1 預凍溫度 預凍溫度是冷凍干燥過程中的一個重要參數，對產品的質量影響較大。精密量取前列地爾納米乳4份，每份1mL。于乳劑中分別加入10%（W／V）海藻糖1mL，輕微振蕩至其完全溶解后，分別放入低溫冰箱（－20℃，12h）、（－45℃ ，12h）、（－70℃，12h）中預凍，隨后進行冷凍干燥除去水分。凍干結束后，將制得的凍干乳加入注射溶媒進行復溶，經水合振蕩后還原成乳劑，觀察外觀，測定粒徑變化。結果顯示：三種預凍溫度均能使凍干品表面呈光滑的玻璃狀，復溶外觀良好。粒徑分別為（173.5±34.6）nm、（175.3±35.1）nm、（171.5±33.9）nm。三種預凍溫度均能達到良好保護效果，為節約能源選取－20℃12h為最佳預凍溫度。

2.6.2 凍干機初始溫度 預凍就是將溶液中的自由水固化，賦予待干燥的產品于干燥前相同的形態，防止抽真空干燥時起泡、濃縮和溶質移動等不可逆變化的發生。因此冷凍干燥過程預凍溫度必須低于樣品最低共熔點10～20℃（圖2）。本實驗選擇－45℃為凍干機預凍溫度。

圖2 凍干納米乳最低共熔點和玻璃化轉變溫度

2.6.3 預凍時間 將加入海藻糖作為保護劑的樣品平行制得3份，分別于－45℃冷阱中預凍1、2、4h時，而后進行冷凍干燥除去水分。通過產品質量，確定最佳預凍時間。試驗結果顯示，預凍1h樣品平均粒徑較大為（203.3±34.2）nm；預凍2h、4h平均粒徑無顯著差異，本實驗確定預凍時間為2h。

2.6.4 干燥溫度、時間 ①第一階段干燥：按凍干保護劑加入比例精密量取樣品9份，共18mL。于－20℃預凍12h，－45℃冷阱中預凍2h后進行干燥除去水分，將樣品分別設置第一階段干燥溫度為－40℃、－35℃、－30℃。干燥時間分別為24、36、48h。通過產品質量確定第一階段干燥溫度和時間，平行做三組。由圖3－B看出，干燥溫度為30℃時產品平均粒徑變化較大；干燥溫度為40℃、35℃時粒徑變化則不明顯。干燥時間為24h時，產品平均粒徑波動明顯。干燥時間為36h、48h干燥溫度為35℃、40℃產品質量較優。從能源節約方面考慮第一階段干燥時間保持36h，溫度保持－35℃；② 第二階段干燥：按上述已確定條件處理樣品，將樣品第一階段溫度設置為－35℃干燥36h，而后第二階段干燥溫度設置為10℃、15℃、20℃，干燥時間分別為4h、6h、8h。通過產品含水量確定第二階段干燥溫度及時間。由圖3－A看出，干燥時間為10℃時，含水量在4%以上，不利于凍干樣品的保護；而干燥溫度15℃、20℃時含水量差別不明顯，且此時干燥時間基本無影響。含水量在1.5%以內時表示很難除去，但對樣品穩定性影響不大；而溫度越高對設備質量要求越高，干燥時間越長，能源消耗越大。綜合考慮，第二階段干燥時間為6h、溫度為15℃。

圖3 干燥時間及溫度與平均粒徑（A）、含水量（B）的關系

2.7 凍干乳的表征

2.7.1 掃描電鏡 分別取海藻糖、麥芽糖做保護劑的凍干樣品少量，快速放入兩面的SEM樣品盤后放入JFC－1600，調加速電壓15kV進行噴金后放入S－3400N掃描電鏡進行觀察（圖4－a，b）。加入海藻糖做保護劑，納米乳能夠完整的嵌入海藻糖基質中，形成多層次結構，有效保護納米乳凍干過程免受破壞；而麥芽糖則不能形成有效保護結構。

2.7.2 透射電鏡 取樣品放入分析池，用純化水分散稀釋后，滴入銅網分析片，用2%的磷鎢酸著色。在空氣中干燥后，置于透射電鏡觀察（如圖4－c，d）。可以看到納米乳凍干前后乳粒呈球形，且分布均勻，無明顯變化。

圖4 前列地爾掃描電鏡和透射電鏡

2.8 凍干納米乳穩定性

將納米乳與凍干乳樣品同時置于室溫放置3個月測定其粒徑及含量變化（如表4）。前列地爾納米乳經凍干后放置3個月平均粒徑、含量無顯著變化，而未經凍干的納米乳常溫放置3個月后含量下降約7.3%，雜質A1增至3.4μg／mL，已超出其限度3.0μg／mL。前列地爾凍干納米乳穩定性明顯優于前列地爾納米乳。

表4 前列地爾納米乳及凍干乳常溫放置3個月綜合指標變化

3 討論

納米乳屬于熱力學不穩定體系，前列地爾納米乳不能夠常溫保存，滅菌過程易加速降解，增加其雜質含量。將其制成凍干納米乳后，室溫長期放置能夠保證其粒徑及主藥含量保持不變，同時減少滅菌過程對主藥含量的影響，雜質A1能夠有效控制在限量3μg／mL以內。因此將前列地爾制成凍干納米乳劑有著廣闊的應用前景。

凍干保護劑的選擇或用量控制不好［8］，凍干后的產品容易形成不易溶解的蜂窩狀或粉狀，最終導致納米乳不能恢復原有性狀。實驗中15%的蔗糖出現噴瓶現象可能是由于產品濃度大，不均一，加熱過程中造成制品上下溫差過大，下部制品的結晶不是從固體到氣體升華，而是從固體、液體到氣體蒸發，形成噴瓶［9］。5%的糖類由于濃度過低沒有能夠有效降低制品的玻璃化轉變溫度，而達不到骨架支撐作用。10%海藻糖能起到很好的保護作用，但作為凍干保護劑，暴露在空氣中時海藻糖較易吸潮。更優選擇有待于進一步深入研究。

干燥過程分為升華干燥和解析干燥［10］。升華干燥過程不允許冰出現融化，水蒸氣必須低于物料凍結點的飽和蒸汽壓。本實驗第一階段干燥不能加熱過快，否則制品的上下部位易出現不均勻。凍干產品易吸潮，尤其在含有少量水分時，因此本實驗在第二階段干燥時嚴格控制干燥溫度，目的就是最大限度降低水分含量，當含水量在1.5%以下時，則對產品質量基本無影響。

［1］MICHEL G，CHANTAL T，JEAN FP，et al.Basal concentrations of free and esterified monohydroxylated fatty acids in human blood platelets［J］.Clin Chem，1997，43（12）：2403－2407.

［2］ABTULLAH MILCAN，EMRAH ARSLAN，OZLEN TUBAY BAGDATOGLU，et al.The effct of alprostadil on ischemiareperfusion injury of peripheral nerve in rats［J］.Pharmacol Res，2003，49（2004）：67－72.

［3］NICHLOAS M，PANTELIDES，SACHIN A ，et al.Erectile dysfunction following radical prostatectomy：a review［J］.Br J Med Sur Urol，2011，4（6）：227－242.

［4］姜賽平，田治科，盧曉陽.納米結構脂質載體的制備及性質研究進展［J］.中國醫藥工業雜志，2008，39（10）：773－776.

［5］TAPAN KG，CHHATRAPAL C，AJAZUDDIN，et al.Prospects of pharmaceuticals and biopharmaceuticals loaded microparticles prepared by double emulsion technique for controlled delivery［J］.Saudi Pharm J，2013，21（2）：125－141.

［6］MATTHEW JB，ZHANG T，TANJA W，et al.Identification of ancient remains through genomic sequencing［J］.Genome Res，2008，18（8）：1347－1353.

［7］LI F，WANG T，HE HB，et al.The properties of bufadienolides－loaded nano－emulsion and submicro－emulsion during lyophilization［J］.Int J Pharm，2008，349（1－2）：291－299.

［8］鄧禮荷，韋敏燕，湯晨懿，等.凍干工藝及保護劑對羥基喜樹堿脂質體質量的影響［J］.中國醫藥工業雜志，2012，43（1）：30－34.

［9］郭樹國.人參真空冷凍干燥工藝參數試驗研究［D］.沈陽：沈陽農業大學，2012.

［10］NARMELA A，MANSOUREH M.Effects of drying，packaging，and temperature on the quality of fried onion slices［J］.J Food Sci，2010，75（5）：251－254.