替米沙坦治療糖尿病腎病過程中PPARγ的作用*

劉晏明,羅華麗,蔣先洪,文津,張劍彬

(重慶醫科大學附屬永川醫院腎內科,永川 402160)

替米沙坦治療糖尿病腎病過程中PPARγ的作用*

劉晏明,羅華麗,蔣先洪,文津,張劍彬

(重慶醫科大學附屬永川醫院腎內科,永川 402160)

目的 進一步明確替米沙坦治療糖尿病腎病的機制,探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)通路在其中的作用。方法構建糖尿病腎病大鼠模型,將其隨機分為空白對照組、替米沙坦組(5 mg·kg-1·d-1)、替米沙坦聯合PPARγ抑制劑治療組(替米沙坦5 mg·kg-1·d-1;GW9662 0.5 mg·kg-1·d-1),治療12周后檢測并比較3組SD大鼠的血、尿生化指標及腎臟質量,ELISA法檢測并比較3組SD大鼠血液中白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達水平,比較分析各組腎臟組織病理變化。Western-blot或免疫組化法檢測并比較3組SD大鼠腎臟組織HGF的表達,以及活化的NF-κB(p65)的水平。結果替米沙坦能夠顯著改善糖尿病腎病大鼠的血、尿生化指標,減輕腎臟質量,縮小腎小球體積,減輕系膜增生,減少炎性細胞浸潤;明顯降低血液中IL-1、IL-6、TNF-α表達水平,及腎臟組織中活化的NF-κB(p65)的水平,增加腎臟組織中HGF表達。但以上變化能被PPARγ抑制劑GW9662有效逆轉。結論PPARγ相關通路活化可能在替米沙坦治療糖尿病腎病中起重要作用。

替米沙坦;GW9662;過氧化物酶體增殖物激活受體γ;腎病,糖尿病

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的常見并發癥,臨床主要表現是蛋白尿。關于該病發生發展的機制研究日益透徹,其中,炎癥反應被認為發揮了重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)介導的下游分子活化是新近研究的熱點,研究發現PPARγ與配體結合后可競爭性結合協同活化因子CBP及p300,從而使轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)不能被有效活化,最終抑制由信號傳導及STAT引起的炎癥反應,包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白細胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)等炎性因子的生成[1]。有報道證實,PPARγ激活后具有通過抑制炎癥因子,減少氧化應激而保護腎臟的作用,因此被認為與DN的發生發展密切相關[2]。替米沙坦是一種新型的特異性血管緊張肽Ⅱ受體拮抗藥,被廣泛用于高血壓及相關靶器官損傷的治療中,包括DN的治療,其可以明顯改善患者的蛋白尿癥狀[3]。然而,在DN的治療過程中,替米沙坦的作用機制尚未完全明確,PPARγ通路的激活在其中是否具有重要作用仍不清楚。

1 材料與方法

1.1 動物 健康8周齡斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠65只,普通級,雄性,體質量(190± 10)g,購買于重慶醫科大學實驗動物中心,動物合格證號:SCXY(渝)2012-004,實驗動物生產許可證號: SYXK(渝)2012-006。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自美國Sigma公司,批號:120301;檢測IL-1、IL-6、TNF-α表達的酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒均購自Santa Cruz公司,批號依次為:sc-10798,sc-10635,sc-10029;肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、NF-κB(p65)、組蛋白抗體均購自Abcam公司,批號依次為:ab21047, ab23218,ab20148;內參抗體購自Epitomics公司;總蛋白提取試劑、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購自碧云天公司,批號依次為:P0033,P0132,P0237;蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo Fisher公司,批號:PC0020。替米沙坦(蘇州東瑞制藥有限公司,批準文號:國藥準字H20070149,批號:20130277);PPARγ抑制劑GW9662(Alexis公司,批準文號:國藥準字cw201008,批號:nc208735)。

1.3 儀器 CX9型全自動生化分析儀(美國Beckman公司);XO-1200型超聲裂解儀(江蘇先歐科技公司); ST16R型冷凍離心機(Thermo公司);WD-9408C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.4 動物模型構建 將健康雄性SD大鼠左腎切除,1周后開始構建DN大鼠模型,所有SD大鼠禁食10 h,單次腹腔注射鏈尿佐菌素(streptozotocin,STZ, 50 mg·kg-1),STZ用0.1 mol·L-1無菌檸檬酸緩沖溶液配制,72 h后取尾尖血測空腹血糖,以血糖值＞16.65 mmol·L-1、連續3 d血糖穩定者為模型。結果成功建模62只,余3只建模失敗。

1.5 動物分組與給藥 選取成功建立DN的SD大鼠60只,將其隨機分為3組。空白對照組:不予以任何治療,僅予以0.9%氯化鈉溶液灌胃;替米沙坦組:將替米沙坦溶于水中,按5 mg·kg-1·d-1劑量灌胃;替米沙坦聯合PPARγ抑制劑GW9662組:將替米沙坦(5 mg·kg-1·d-1)聯合PPARγ抑制劑GW9662 (0.5 mg·kg-1·d-1)溶于水后灌胃。治療12周后處死并收集下腔靜脈血及處死前24 h尿,留取右側腎臟,稱質量,部分腎組織以10%甲醛固定,其余組織置于-80℃冰箱中凍存。

1.6 蛋白提取 取少量腎臟組織碾磨成粉末狀,過程中予以液氮降溫,之后將其收集于干凈EP管中,加入提前混有蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑的細胞裂解液,在冰上用超聲裂解儀將組織裂解完全。在12 000×g條件下離心15 min,輕取上清液。用聚氰基丙烯酸正丁酯法測定蛋白液濃度,變性后于-30℃冰箱保存備用。

1.7 蛋白免疫印跡雜交(Western blot)檢測 按既往常規操作進行,每孔蛋白上樣量為40μg,SDS-PAGE法電泳分離,濕法轉至PVDF膜,室溫脫脂牛奶封閉2 h,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,增強化學發光法顯色,于暗室用膠片壓片法顯影,以GAPDH作為比對內參。

1.8 ELISA檢測 IL-1、IL-6、TNF-α的檢測嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.9 免疫組化 按免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)說明書操作,用蘇木精復染,中性樹膠封片。

2 結果

2.1 替米沙坦對SD大鼠血、尿生化指標及腎臟質量的影響 3組SD大鼠予以相應治療12周后,分別檢測血糖、血肌酐、尿蛋白,結果發現替米沙坦能顯著降低SD大鼠血糖(F=20.812,P＜0.01)、血肌酐(F= 219.534,P＜0.01)及尿蛋白(F=39.357,P＜0.01),均差異有統計學意義;處死大鼠觀察腎臟外觀發現,空白對照組大鼠腎臟體積較替米沙坦組大鼠明顯增大,表面顆粒型感強,顏色較深紅,前者腎質量/體質量高于后者,差異有統計學意義(F=147.568,P＜0.01)。在聯用PPARγ特異性抑制藥GW9662的情況下,替米沙坦對糖尿病腎病的療效有所減低。與單純使用替米沙坦相比,聯用GW9662的大鼠的血糖(F=21.237,P＜0.01)、血肌酐(F=198.741,P＜0.01)、尿蛋白(F= 35.132,P＜0.01)均有所增高,但仍明顯低于空白對照組的大鼠。這可能和替米沙坦也是血管緊張素受體Ⅱ特異性阻滯藥相關。見表1。

2.2 3組SD大鼠腎臟病理切片結果 3組SD大鼠予以相應治療12周后,光鏡下比較腎臟組織蘇木精-伊紅(HE)染色切片發現,空白對照組大鼠腎組織可見部分腎小球體積明顯增大,系膜明顯增生,伴間質中性粒及單核淋巴細胞大量浸潤(圖1A)。替米沙坦組大鼠腎組織中腎小球體積較空白對照組有縮小,系膜增生不明顯,炎性細胞浸潤現象也得到緩解(圖1B)。然而,替米沙坦聯合PPARγ抑制藥GW9662后腎小球體積又有增大趨勢,系膜增生及炎性細胞浸潤現象較替米沙坦組嚴重(圖1C)。

2.3 PPARγ對糖尿病腎病中炎癥遞質表達的影響 前期動物模型實驗已經證實替米沙坦具有改善DN癥狀的療效,且在一定程度上依賴于PPARγ相關通路的活化,采用PPARγ抑制藥GW9662可以明顯減弱替米沙坦治療DN的療效,這初步表明PPARγ通路在替米沙坦治療DN過程中起了介導作用。為進一步證實該觀點,用ELISA法檢測各組大鼠血液中IL-1、IL-6、TNF-α的表達水平。結果發現,替米沙坦能夠顯著降低DN大鼠體內IL-1[(316.37±11.45)pg·mL-1比(126.26± 4.79)pg·mL-1,F=4 688.536,P＜0.01]、IL-6 [(110.93±5.72)pg·mL-1比(56.61±3.96)pg·mL-1,F=1 219.047,P＜0.01]、TNF-α[(1 314.92±85.68) pg·mL-1比(381.30±50.49)pg·mL-1,F=1 762.796,P＜0.01]的表達。與單用替米沙坦組相比,聯用PPARγ抑制藥GW9662后可使DN大鼠體內炎癥因子IL-1 [(190.82±11.67)pg·mL-1比(126.26±4.79) pg·mL-1,F=523.289,P＜0.01]、IL-6[(79.58±6.07) pg·mL-1比(56.61±3.96)pg·mL-1,F=201.137,P＜0.01]、TNF-α[(789.32±50.21)pg·mL-1比(381.30± 50.49)pg·mL-1,F=656.662,P＜0.01]表達上升,但仍明顯低于空白對照組[IL-1:(190.82±11.67)pg·mL-1比(316.37±11.45)pg·mL-1,F=1 178.871,P＜0.01; IL-6:(79.58±6.07)pg·mL-1比(110.93±5.72) pg·mL-1,F=282.607,P＜0.01;TNF-α:(789.32± 50.21)pg·mL-1比(1 314.92±85.68)pg·mL-1,F= 560.254,P＜0.01]。

2.4 PPARγ對HGF、NF-κB(p65)表達的影響 通過Western blot及免疫組化方法檢測PPARγ下游關鍵分子HGF的表達,替米沙坦組大鼠腎臟組織的HGF表達量明顯高于空白對照組(F=163.542,P＜0.01), PPARγ抑制藥GW9662能在一定程度上減弱替米沙坦促使HGF表達增加的效應,但不能將HGF表達量完全降至空白對照組的水平。NF-κB(p65)是重要的炎癥促進因子,其激活所介導的IL-1、IL-6及TNF-α的產生在糖尿病腎病的發生發展中具有重要作用。結果顯示糖尿病腎病大鼠接受替米沙坦治療后,進入胞核內的NF-κB(p65)明顯減少(F=24.983,P＜0.01),聯用PPARγ抑制藥GW9662后,其進入胞核的量又有所增加(F=39.369,P＜0.05),但仍明顯低于空白對照組(F=78.158,P＜0.05)。見圖2～4。

表1 3組大鼠治療后血、尿生化指標及腎臟體質量比值比較Tab.1 Comparison of biochem ical indexes of blood and urine,renal weight among three groups of rats after treatment ±s

表1 3組大鼠治療后血、尿生化指標及腎臟體質量比值比較Tab.1 Comparison of biochem ical indexes of blood and urine,renal weight among three groups of rats after treatment ±s

與空白對照組比較,*1P＜0.01;與替米沙坦組比較,*2P＜0.01Compared with blank control group,*1P＜0.01;compared with telmisartan group,*2P＜0.01

組別血糖/ (mmol·L-1)血肌酐/ (μmol·L-1)尿蛋白/ (mg·L-1)腎臟體質量比/ (×10-3)空白對照組24.77±2.70 136.34±12.31 61.10±4.70 8.34±0.71替米沙坦組19.91±2.70 71.10±10.15 18.10±2.18 4.95±0.78替米沙坦聯合GW9662組22.83±2.89*1*2103.51±11.57*1*235.35±4.97*1*26.36±0.67*1*2

A.空白對照組;B.替米沙坦組;C.替米沙坦聯合GW9662組圖1 3組大鼠治療后腎臟組織病理切片圖(×400)A. blank control group;B. telmisartan group;C. combination of telmisartan and GW9662 groupFig.1 Pathology of renal tissue in three groups of rats after treatment(×400)

A.空白對照組;B.替米沙坦組;C.替米沙坦聯合GW9662組圖2 3組大鼠治療后腎臟組織中HGF、活化NF-κB (p65)電泳圖A. blank control group;B. telmisartan group;C. combination of telmisartan and GW9662 groupFig.2 Electrophotogram of HGF and activated NF-κB ( p65 ) of renal tissue among three groups of rats after treatment

3 討論

A.空白對照組;B.替米沙坦組;C.替米沙坦聯合GW9662組;與空白對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05;與替米沙坦組比較,*3P＜0.05圖3 3組大鼠治療后腎臟組織中HGF、活化NF-κB (p65)相對表達量比較A. control group; B. telmisartan group; C. combination of telmisartan and GW9662 group; compared with blank control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05;compared with telmisartan group,*3P＜0.05Fig.3 Comparison of relative expression of HGF and activated NF-κB (p65) of renal tissue among three groups of rats after treatment

DN的發病機制復雜,有研究認為其和糖尿病患者體內的高血糖狀態有關,高血糖可以導致腎素血管緊張肽系統(renin angiotension system,RAS)活躍,血管緊張肽Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)與其受體結合效率明顯增加,腎小球灌注壓增高,腎小球微濾結構破壞,蛋白尿產生[4]。深入研究發現,腎小球微環境在高血糖的持續刺激下,NF-κB可被激活并大量轉入細胞核內,從而調控下游多種分子表達,參與DN的發生發展[5]。此外,大量炎性遞質在該環境下得以大量釋放,包括IL-1、IL-6、TNF-α等,這些因子在細胞外基質增加的過程中均起重要作用。

A.空白對照組;B.替米沙坦組;C.替米沙坦聯合GW9662組圖4 3組大鼠治療后腎臟組織中HGF表達壓片圖(×400)A.blankcontrolgroup;B.telmisartangroup;C.combinationoftelmisartanandGW9662groupFig.4 PathologicalimagesofHGFinrenaltissueinthreegroupsofratsaftertreatment(×400)

與一般AngⅡ受體拮抗藥相比,替米沙坦脂溶性更強,局部藥物聚集濃度更高,發揮效應的時間更長,被廣泛用于高血壓及其并發癥的治療[6]。CAO等[7]認為替米沙坦通過阻斷AngⅡ與其受體結合,緩解腎小球高濾過狀態并降低灌注壓,從而減輕患者蛋白尿狀態。然而,在并發不同程度腎病的糖尿病患者中,替米沙坦被認為具有延緩腎病進展的作用,提示替米沙坦在治療DN方面并不完全得益于其降血壓的功效。有學者認為,替米沙坦、調控胰島素敏感性的作用,能在一定程度上控制患者血糖,這為其治療DN的療效作出了解釋。

PPARγ介導的下游信號活化是近年來研究的熱點,被認為參與脂肪分化、糖脂代謝等多種生理反應中。PPARγ是核內的受體轉錄因子,被認為與過氧化物增殖應答原件結合,從而調控下游多個基因表達[8]。PPARγ激活后被認為與多種細胞因子的分泌相關,后者包括脂聯素、抵抗素、IL-6、TNF-α、纖溶酶原激活物抑制劑-1、單核趨化蛋白-1及血管緊張素肽原等[9]。此外,PPARγ還參與了巨噬細胞功能的調控,從而抑制多種炎性因子的表達[10]。在高糖狀態持續刺激下,腎小球處細胞發生表型轉化,從而導致細胞及外基質增殖活躍,影響了腎小球的正常功能,采用PPARγ激動劑處理后,腎小球組織病理受損程度明顯緩解。這說明PPARγ的活化在DN的治療中具有重要作用[11-12]。

然而,替米沙坦是否在一定程度上通過激活PPARγ而治療DN尚不清楚,深入研究替米沙坦治療DN的機制具有重要意義,這通過應用PPARγ抑制藥GW9662充分說明了這一問題。在DN大鼠模型中,聯用GW9662后可以明顯減弱替米沙坦的治療療效,初步證實了替米沙坦可能通過PPARγ的活化起到治療DN的作用。分析各組大鼠腎臟組織病理形態發現,空白對照組可見腎小球體積明顯增大,系膜明顯增生,間質中性粒及單核淋巴細胞大量浸潤,采用替米沙坦治療后能明顯緩解上述現象。然而,聯用GW9662可減弱替米沙坦對腎臟組織的保護作用。進一步研究PPARγ下游信號分子HGF發現,替米沙坦能夠顯著促使HGF表達增加,HGF具有抗纖維化作用,可延緩DN的病變進展[13]。這表明替米沙坦能活化PPARγ/HGF通路,用PPARγ抑制藥GW9662后HGF表達明顯下調,則進一步證明了該觀點。考慮到炎癥反應在DN的發病中具有重要作用,比較了采用不同治療手段治療后的DN大鼠體內的重要炎癥遞質的表達,包括IL-1、IL-6、TNF-α及NF-κB(p65),均是接受PPARγ調控的下游炎癥遞質。結果發現替米沙坦能夠顯著降低IL-1、IL-6、TNF-α分泌水平,抑制NF-κB(p65)活化進入胞核,相反,GW9662可以有效逆轉以上變化,也提示了PPARγ在替米沙坦治療DN中的作用。

綜上所述,通過動物模型、分子層面初步證實了PPARγ相關通路活化在替米沙坦治療DN中的媒介作用,進一步明確了替米沙坦的藥理機制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.004

Role of PPARγin Treatment of Diabetic Nephropathy by Telmisartan

LIU Yan-ming,LUO Hua-li,JIANG Xian-hong,WEN jin,ZHANG Jian-bin
(Department of Nephrology, Yongchuan Hospital ofChongqing Medical University,Yongchuan 402160,China)

Objective To demonstrate themechanisms underlying the efficacy of telmisartan in diabetic nephropathy, and discuss the role of PPARγin this process.MethodsThe diabetic nephropathy ratmodels were established and random ly assigned to control group,telmisartan group(5 mg·kg-1·d-1)and combination of telmisartan and PPARγinhibitor group (telmisartan:5 mg·kg-1·d-1;GW9662:0.5 mg·kg-1·d-1).After 12 weeks of treatment,the biochemical indexes of blood and urine,kidney weight,renal pathology in each group of diabetic nephropathy rats weremeasured and compared.The levels of IL-1,IL-6 and TNF-αin blood of each group were detected by ELISA and compared.The levels of HGF and activated NF-κB (p65)in renal tissue of each group were detected by Western blotting and compared.ResultsIn diabetic nephropathy rats, telmisartan lowered the levels of serum glucose,serum creatinine,urinary protein and kidney weight,decreased the glomerular volume,mesangial proliferation and inflammatory cell infiltration,reduced blood levels of IL-1,IL-6,and TNF-α,and decreased level of activated NF-κB(p65)in renal tissue.The level of HGF in renal tissue was elevated by telmisartan.Nevertheless,these changeswere partly reversed by PPARγinhibitor GW9662.ConclusionPPARγpresents an important role in treatment of diabetic nephropathy by telmisartan.

Telmisartan;GW9662;Peroxisome proliferator-activated receptorγ;Nephropathy,diabetic

R972.4;R587.1

A

1004-0781(2014)12-1553-06

2013-10-07

2014-03-20

*重慶市永川區科委課題(YCSTC, 2013NC8012);重慶醫科大學附屬永川醫院院內課題(YJQN20120015,YJYJ201308)

作者介紹 劉晏明(1986-),男,重慶人,助理工程師,學士,研究方向:腎病內科。電話:023-85381678,E-mail: cd202020@163.com。

羅華麗(1972-),女,重慶人,主管護師,學士,研究方向:腎病內科。電話:023-85381678,E-mail:326704360 @qq.com。