馬齒莧總黃酮對肝纖維化大鼠轉化生長因子-β1信號因子表達的影響

潘曉麗,熊永愛,譚玉柱,向暉

(成都中醫藥大學藥學院,成都 611137)

馬齒莧總黃酮對肝纖維化大鼠轉化生長因子-β1信號因子表達的影響

潘曉麗,熊永愛,譚玉柱,向暉

(成都中醫藥大學藥學院,成都 611137)

目的 觀察馬齒莧總黃酮對肝纖維化大鼠轉化生長因子(TGF)-β1基因及其蛋白表達的影響,探討馬齒莧總黃酮對肝纖維化的治療作用機制。方法SD大鼠48只,隨機分為正常對照組、模型對照組、復方甘草酸苷組、馬齒莧總黃酮組,各12只。除正常對照組外,其余各組大鼠腹腔注射四氯化碳(CCl4)溶液2 mL·kg-1·d-1復制肝纖維化模型。復方甘草酸苷組灌胃復方甘草酸苷溶液15.75 mg·kg-1,馬齒莧總黃酮組灌胃馬齒莧總黃酮溶液35.6 mg·kg-1,正常對照組和模型對照組灌胃等體積純凈水。30 d后麻醉處死動物剖取肝臟,實時-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western-Blot法檢測肝臟細胞TGF-β1基因及蛋白表達。結果正常對照組、模型對照組、復方甘草酸苷組、馬齒莧總黃酮組大鼠肝臟細胞中TGF-β1基因的相對表達量分別為0.725±0.130,7.493±1.410,3.016±1.240,2.668±1.150。馬齒莧總黃酮可顯著下調TGF-β1基因(P＜0.01)及TGF-β1蛋白(P＜0.01)的表達。結論馬齒莧總黃酮可通過下調大鼠肝纖維化細胞TGF-β1基因及蛋白表達有效治療肝細胞纖維化病變。

馬齒莧總黃酮;肝硬化;轉化生長因子

肝纖維化是指由多種慢性疾病引起的肝臟持續的創傷修復反應而導致的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積和肝臟功能的受損[1]。研究表明,多種細胞參與了肝纖維化的形成,其中激活的肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)是促進ECM過度沉積的主要細胞[2],而多種細胞因子參與了HSC的激活,其中轉化生長因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)被認為是最關鍵的因素[3]。其可激活HSC和調節ECM的合成和降解平衡。以干擾TGF-β1及其細胞信號轉導通路為靶點的抗肝纖維化治療已成為當今研究的熱點。

馬齒莧(Portulaca oleraceaL.)又名瓜子菜,為馬齒莧科馬齒莧屬植物,具有解毒、抗炎、利尿、鎮痛功效。馬齒莧富含黃酮、皂苷、生物堿等天然活性成分,具有多種藥理作用,如抗菌、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗心血管疾病、增強免疫力等[4]。馬齒莧黃酮是馬齒莧中主要活性成分之一,具有降脂、抗血栓、抗氧化等藥理活性,主要有槲皮素、山奈素、楊梅素、芹菜素、木犀草素等[5]。筆者尚未見關于馬齒莧黃酮對肝纖維化病變的治療或保護作用的報道,筆者在本實驗中擬以馬齒莧總黃酮為研究對象,通過對肝纖維化病變過程中肝細胞TGF-β1信號轉導通路中的關鍵成員TGF-β1的干預,初步研究馬齒莧黃酮預防肝纖維化病變的作用機制,為研究肝纖維化病變細胞TGF-β1信號轉導通路中其他成員奠定基礎,也為開發馬齒莧肝靶向制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 斯波雷格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠48只,SPF級,雌雄各半,體質量180～220 g。由成都達碩生物科技有限公司提供,動物合格證號:SCXK (川)2008-24。使用許可證號:SCXK(川)2009-124。飼養環境:溫度(22±3)℃,濕度(55±5)%。

1.2 藥物與試劑 馬齒莧總黃酮(自制)。陽性藥:復方甘草酸苷,日本米諾發源制藥株式會社秋山片劑株式會社生產,批號:20121014。RNAiso Plus Kit,批號:BK3303；PrimeScript RT reagent Kit,批號:BK501；SYBR Premix Ex Taq II Kit,批號:BK402,均購自大連寶生物工程有限公司。二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(凱基生物科技發展有限公司)；蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術研究所,批號:P0015)；聚丙烯酰胺凝膠電泳預染蛋白MAKER(美國FERMENTAS公司,批號:SM0441)；TGF-β1兔抗鼠一抗(Cellsignalling公司,批號:9103)。四氯化碳溶液(Sigma公司,純度＞99.9%,批號:S1272-03-9)。

1.3 儀器 電子天平(BS-600L,上海友聲衡器有限公司)；實時-聚合酶鏈反應(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴增儀(PIKORed96,美國ThermoFisher儀器有限公司)；勻漿機(DY89-I,寧波新芝生物科技股份有限公司)；垂直電泳槽(UK-33,美國Bio-RAD公司)；電泳儀(DYY-6C,北京六一儀器廠)；化學發光凝膠成像儀(美國Bio-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組與給藥 SD大鼠48只,隨機分為4組,每組12只,分別為:①模型對照組:給予等體積純凈水；②復方甘草酸苷組:給予復方甘草酸苷溶液15.75 mg·kg-1；③馬齒莧總黃酮組:給予馬齒莧總黃酮溶液35.6 g·kg-1；④正常對照組:給予等體積純凈水。于實驗第1天開始灌胃給予藥物或純凈水,連續30 d。

1.4.2 大鼠肝纖維化模型的建立 實驗第1天開始,除正常對照組外,其余各組大鼠按2 mL·kg-1·d-1劑量腹腔注射四氯化碳溶液,正常對照組大鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液,連續30 d。實驗第31天,用20%水合氯醛溶液麻醉處死動物,使用大號鈍剪刀迅速剖取大鼠肝臟,將其置于冰盤上,于冰冷0.9%氯化鈉溶液中洗凈血跡后,裝于焦碳酸二乙酯溶液處理過的EP管中,放置液氮中快速冷凍,然后轉移至-80℃超低溫冰箱凍存,待做RT-PCR；取另部分肝臟放入高壓滅菌的空白EP管內,置-80℃冰箱凍存,待做Western-Blot。

1.4.3 肝臟組織TGF-β1基因表達檢測 Trizol法提取大鼠肝臟總RNA,分光光度法測定其在波長為260與280 nm處的吸光度(A值),用A260/A280估計RNA純度,約2.0,提示為RNA純品。按試劑盒說明進行逆轉錄和RT-PCR擴增。RT-PCR數據收集由7000 System SDS Software軟件完成,通過軟件計算所有樣品的Ct值,以β-actin作為內參照基因進行校準,采用2-△△Ct方法對TGF-β1基因表達進行相對定量:△Ct=Ct (target)-Ct(ref)；Avg.△Ct(calibrator)=Avg.Ct (target,calibrator)-Avg.Ct(ref,calibrator)；△△Ct=△Ct-Avg.△Ct(calibrator)；2-△△Ct表示通過參照基因校準的TGF-β1基因的相對表達水平。TGF-β1和βactin引物信息見表1。

表1 TGF-β1和β-action引物Tab.1 Primer of TGF-β1and β-action

1.4.4 肝臟組織TGF-β1蛋白表達檢測 細胞裂解法提取大鼠肝臟總蛋白,Lowry法蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳,Western-Blot蛋白質印跡。應用Tanon-2500R型全自動數碼凝膠成像系統成像,使用ScionImage軟件對蛋白電泳帶進行灰度值分析,以βactin作為內參照蛋白進行校準,采用TGF-β1蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來表示TGF-β1的相對蛋白表達水平。

1.4.5 統計學方法 使用SPSS 17.0版軟件進行統計分析。數據以均數±標準差(±s)表示,組間采用單因素方差分析,方差齊者組間進行LSD檢驗,方差不齊者進行Tamhane’s T2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝臟細胞TGF-β1mRNA表達檢測結果

2.1.1 RT-PCR熔解曲線分析 各組大鼠TGF-β1和β-actin熔解曲線中均有單一的主峰,TGF-β1的熔解溫度(Tm值)均為86.12℃,β-actin的Tm值均為85.24℃,相同擴增條件下重復多次,得到的TGF-β1和β-actin熔解溫度上下浮動不超過1℃,熔解曲線單一峰無非特異性熒光,說明產物特異性強,無引物二聚體,定量準確,見圖1,2。

圖1 TGF-β1熒光定量PCR熔解曲線Fig.1 RT-PCR melt curve of TGF-β1

圖2 β-action熒光定量PCR熔解曲線Fig.2 RT-PCR melt curve of β-action

2.1.2 TGF-β1基因的2-△△CT值 正常對照組、模型對照組、復方甘草酸苷組、馬齒莧總黃酮組大鼠肝細胞中TGF-β1基因的2-△△CT值分別為0.725±0.130,7.493± 1.410,3.016±1.240,2.668±1.150。與正常對照組比較,模型對照組大鼠肝臟細胞中TGF-β1基因的2-△△CT值顯著增大(P＜0.01),提示TGF-β1基因在纖維化肝細胞中呈過表達；與模型對照組比較,馬齒莧總黃酮組大鼠肝臟細胞中TGF-β1基因的2-△△CT值顯著減小(P＜0.01),提示馬齒莧總黃酮可顯著抑制大鼠纖維化肝細胞異常表達TGF-β1基因。TGF-β1基因和β-actin擴增曲線分別見圖3,4。

2.2 大鼠肝臟細胞TGF-β1蛋白表達檢測結果 見圖5。與正常對照組比較,模型對照組大鼠肝臟細胞中TGF-β1蛋白表達顯著增大(P＜0.01),與RT-PCR結果一致；與模型對照組比較,馬齒莧總黃酮組大鼠肝臟細胞中TGF-β1蛋白表達顯著減小(P＜0.01)。各組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot見圖6～9。

圖3 TGF-β1熒光定量擴增曲線Fig.3 Fluorescence quantitative expansion curve of TGF-β1

圖4 β-actin熒光定量擴增曲線Fig.4 Fluorescence quantitative expansion curve of βactin

3 討論

肝纖維化常見的原因是由于乙醇、缺血、寄生蟲、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、自體免疫攻擊、非酒精性脂肪肝疾病、藥物治療,以及肝毒素等因素誘發肝細胞損傷,導致肝Kupffer細胞、肝竇狀內皮細胞、肝成纖維細胞等其他類型肝細胞以及遷移的炎性細胞活化并釋放大量的細胞因子和可溶因子,與此同時這些因子導致HSC或肝MFB細胞活化、分化與增殖,合成大量ECM,并逐漸沉積從而引起肝纖維化[6-7]。肝細胞、炎性細胞以及細胞因子之間相互影響并且形成一個復雜的網絡結構。隨著肝細胞的慢性損傷和纖維化,肝臟的結構和新陳代謝受到嚴重破壞,最終會導致肝硬化甚至肝癌,對人類的健康和生命具有極大的威脅。因此,對肝纖維化疾病發生發展過程中的最重要的細胞因子TGF-β1的動態變化及作用進行追蹤,對于研究肝纖維化疾病的發生機制及治療具有重要意義。

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05圖5 4組大鼠肝臟TGF-β1蛋白相對表達量Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05Fig.5 Relative expression of TGF-β1protein of livers in four groups of rats

圖6 正常對照組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot圖Fig.6 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from normal control group

圖7 模型對照組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot圖Fig.7 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from model control group

本研究顯示,馬齒莧總黃酮可顯著下調大鼠肝細胞中TGF-β1基因及其蛋白表達,提示馬齒莧總黃酮可能通過調節大鼠肝組織中TGF-β1蛋白的信號傳導通路,避免其過度激活,進而抑制了TGF-β1/Smad7信號通路其他關鍵成員的活化,最終減少了炎性因子的釋放,減輕了肝細胞炎癥,起到一定的抗肝纖維化作用。

圖8 復方甘草酸苷組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot圖Fig.8 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from glycyrrhizin aqueous group

圖9 馬齒莧總黃酮組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot圖Fig.9 Western-Blot analyisis on TGF-β1protein of livers in rats from total flavonoids group

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DOI 10.3870/yydb.2014.09.006

Effects of Total Flavonoids from Portulaca on Transforming Growth Factor β1in Rats with Hepatic Fibrosis

PAN Xiao-li,XIONG Yong-ai,TAN Yu-zhu,XIANG Hui
(School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective To explore the effects of total flavonoids from portulaca against liver fibrosis in rats by detecting TGF-β1gene and protein expressions.MethodsA total of 48 SD rats were randomly divided into normal control,model control,glucyrrhizin aqueous,and total flavonoids groups,with 12 rats in each group.Except those in the normal control group, rats in other groups were intraperitoneally injected with 2 mL·kg-1·d-1carbon tetrachloride to induce liver fibrosis.Rats in glucyrrhizin aqueous group and total flavonoids ones were intragastrically administered with 15.75 mg·kg-1of glucyrrhizin aqueous solution or 35.6 mg·kg-1of total flavonoids aqueous solution,respectively.The normal and model control groups were administered with equal volume of aqueous solution.Thirty days later,rats were sacrificed by anesthesia.Livers were obtained to detect TGF-β1gene and protein expressions by RT-PCR and Western-Blot.ResultsRelative gene expression of TGF-β1in the normal control,model control,glucyrrhizin aqueous and flavonoids groups was 0.725±0.130,7.493±1.410,3.016±1.240,and 2.668±1.150,respectively.Total flavonoids from portulaca significantly reduced the gene(P＜0.01)and protein(P＜0.01) expressions of TGF-β1.ConclusionEfficacy of total flavonoids from portulaca in treating hepatic fibrosis may be related to decreased TGF-β1expression in rats.

Total flavonoids from portulaca;Liver cirrhosis;Transforming growth factors

R285.5；R575.2

A

1004-0781(2014)09-1140-04

2013-04-24

2013-09-16

潘曉麗(1980-),女,重慶人,講師,碩士,主要從事中藥藥效物質基礎與質量標準化研究。電話:(0) 13880768673,E-mail:panpan_1388@sohu.com。