枸杞類胡蘿卜素的分離純化方法

郭 濤

（豐益上海生物技術研發中心有限公司，上海200137）

枸杞是茄科枸杞屬的多分枝灌木植物，是名貴的藥材和滋補品，能夠養肝明目安神，令人長壽。枸杞的產區主要集中在西北地區，寧夏的枸杞最為著名。有研究發現，枸杞中含有豐富的類胡蘿卜素。

類胡蘿卜素是一類碳氫化合物——胡蘿卜素及它們的氧化衍生物——葉黃素類的總稱，這類有機化合物的特點是分子中含有多個不飽和共軛及非共軛雙鍵，其分子量大小、雙鍵數目及類型、含氧原子的數量、官能團類型和分子構型等特征的不同決定了它們理化特性的差異。類胡蘿卜素具有親脂性，幾乎不溶于水，易溶于有機溶劑，因此通常采用有機溶劑提取類胡蘿卜素。對于高等綠色植物而言，類胡蘿卜素往往與另一種脂溶性色素——葉綠素混雜在一起，因而增加了類胡蘿卜素提取、分離和純化的難度。因此枸杞中類胡蘿卜素的分離研究是該領域的研究熱點之一。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

材料：枸杞，購于農貿市場；

試劑：正己烷、石油醚、丙酮、無水乙醇、石英砂、碳酸鈉、BHT、氫氧化鉀、甲醇均為AR級（國藥集團）；

儀器：高速組織搗碎機，江蘇江陰科研器械廠；

紫外-可見分光光度計（UV-120-02），Shimadzu Co.（Japan）；

紫外 -可見光譜掃描分析儀（UV-265FW），ShimadzuCo.（Japan）；

玻璃層析柱（3.5cm×20cm），定制；

層析缸（100mm×200mm，200mm×200mm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞色素提取物的制備

有一次，孩子很委屈地找朝敏說：“媽媽，同學們為什么都不理我？爸爸不是說只要樹立威風就不愁沒有朋友了嗎？難道爸爸都是騙人的？”

準確稱取200g枸杞，洗凈并瀝干后混入石英砂、碳酸鈉和BHT，在控溫多用高速組織搗碎機中用900mL萃取劑分3次攪拌萃取（室溫），每次提取時間40min。將提取液抽濾合并轉入1500mL分液漏斗中，加入100mL的蒸餾水搖勻，避光靜置分層，棄去水相，反復水洗3次去雜，在有機相中加適量無水硫酸鈉，避光靜置除水1h，過濾，將濾液在40℃以下真空濃縮至干（回收溶劑），即得到枸杞色素提取物，用200mL溶劑溶解即得枸杞色素提取液，充氮密封避光低溫保存備用。

1.2.2 枸杞色素提取物的皂化（枸杞總類胡蘿卜素的皂化法制備）

取枸杞色素提取液100mL置于250mL棕色試劑瓶中，加入20mL 40%（w/v）氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻后充氮置于暗處，在室溫下皂化12h，將皂化液轉入分液漏斗，棄去水相，將石油醚層多次用蒸餾水洗至中性，再用無水硫酸鈉干燥1h，過濾，在40℃以下減壓濃縮蒸發至干，即得枸杞色素非皂化物（總類胡蘿卜素），用100mL石油醚溶解即得枸杞總類胡蘿卜素溶液，置于棕色瓶中，充氮密封，避光低溫保存備用。

1.3 分析方法

1.3.1 不同溶劑提取液中總類胡蘿卜素含量測定公式

根據經驗公式[4]，采用分光光度法測算不同溶劑提取液中總類胡蘿卜素含量。用前3種溶劑浸提時直接套用對應的色素含量計算公式，用石油醚或石油醚-丙酮浸提時，把浸提液真空濃縮至干后轉溶于同體積的丙酮中，利用類胡蘿卜素在丙酮中的經驗公式測算相應類胡蘿卜素含量。通過比較每種溶劑浸提液中類胡蘿卜素含量的多少，即可選擇出合適的溶劑。各提取液中總類胡蘿卜素含量測定公式分別如下：

在甲醇中：

上式中：D為葉綠素a濃度（μg/mL提取液），E為葉綠素b濃度（μg/mL提取液），F為總類胡蘿卜素濃度（μg/mL提取液），G為總類胡蘿卜素含量，λ為不同波長的光密度。

1.3.2 枸杞類胡蘿卜素提取率的測定

精確稱取10.0000g枸杞粉按1.2中試驗方法極限浸提，攪拌研磨充分提取色素，定容定量，用分光光度法測定色素濃度，重復3次，取平均值，用于計算總類胡蘿卜素含量的提取率。

2 結果與分析

2.1 溶劑對浸提效果的影響

分別選用甲醇、無水乙醇、丙酮、石油醚-丙酮（1:1，v/v）四種溶劑按照1.2.1方法進行浸提，浸提結果見表1。

表1 不同溶劑對浸提效果的影響Tab.1 The effects of different solvents on the extraction

由表1可知，從總類胡蘿卜素濃度F來看，浸提效果丙酮>無水乙醇>石油醚-丙酮 (1:1，v/v)>甲醇；從總類胡蘿卜素與葉綠素a和b之和的比值（G）來看，石油醚-丙酮（1:1，v/v）>丙酮>無水乙醇>甲醇。因此，綜合考慮浸提效果、安全性和成本等因素，選用石油醚-丙酮混合溶劑作為浸提溶劑效果最好。

2.2 枸杞類胡蘿卜素提取條件的優化

分別考察浸提時間、浸提次數、料液比及體積比對枸杞類胡蘿卜素提取效果的影響，見圖1。

如圖1（a）所示，浸提時間為2h時，提取液的類胡蘿卜素濃度為1.253μg/mL，浸提時間為2.5h時，類胡蘿卜素濃度為1.254μg/mL，僅增加0.08個百分點。因此浸提時間控制在2h以內為好。

如圖1（b）所示，浸提次數越多，類胡蘿卜素提取越完全。浸提3次時類胡蘿卜素濃度為0.795μg/mL，與浸提1次相比，濃度增加了32.5%；浸提4次和5次的類胡蘿卜素濃度分別為0.807μg/mL和0.811μg/mL，與浸提3次相比，類胡蘿卜素濃度增加較小，分別增加1.51%和0.49%，故浸提次數選擇3～4次。

圖1（c）比較了料液比對浸提效果的影響。當料液比在90g/mL以內時，所提取的類胡蘿卜素濃度隨料液比值的增大而明顯增加，當料液比為120g/mL時的類胡蘿卜素濃度為1.164μg/mL，超過120g/mL以后，類胡蘿卜素濃度僅增加0.09%。因此，料液比應不超過120g/mL。

圖1（d）比較了石油醚-丙酮混合溶劑的不同比例對浸提效果的影響。圖中的橫坐標1、2、3、4、5分別代表石油醚-丙酮體積比 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3。可見隨著丙酮在混合溶劑中所占比例的增加，溶劑極性也逐步增強，當石油醚與丙酮的體積比小于1:1時，溶劑極性較強，反之則較弱。隨著溶劑極性的增強，類胡蘿卜素的濃度逐漸增大，當石油醚與丙酮的比例為1:3時，濃度達到最大。

圖1 浸提條件對枸杞類胡蘿卜素浸提效果的影響Fig.1 Effecton carotenoidsextraction from Lycium Chinensis byextractingcondition

按照1.3.2方法測得枸杞總類胡蘿卜素的含量為552.57mg/kg，用2.2最佳浸提條件下其總類胡蘿卜素的提取率可達95.5%。

2.3 枸杞類胡蘿卜素柱層析分離和純化條件

2.3.1 吸附劑選擇

以枸杞色素提取物和不皂化物（總類胡蘿卜素）為材料，洗脫劑選擇正己烷-丙酮=90:10（v/v），吸附劑嘗試為硅膠、氧化鋁、聚酰胺、碳酸鎂、氧化鎂、碳酸鎂-硅藻土=1:1（w/w）、氧化鎂-硅藻土=1:1（w/w）、氧化鎂-硅藻土=1:2（w/w）、氧化鎂-硅藻土=1:3（w/w），不同吸附劑對洗脫的影響見表2。

表2 不同吸附劑對洗脫的影響Tab.2 The effect of different elution adsorbent

表2顯示，將氧化鎂與硅藻土按不同比例混合裝柱的分離效果明顯好于其它，并且隨著硅藻土的增加，洗脫速度依次加快，綜合比較分離速度、分離效果、柱床穩定性及可再生性，以氧化鎂-硅藻土=1:2（w/w）的組合為最佳吸附劑。

2.3.2 枸杞類胡蘿卜素薄層層析分離和純化條件

以2.3.1分離得到的類胡蘿卜素及不皂化物為材料，用硅膠G薄層層析對它做進一步的分離和純化。吸附劑選擇為氧化鎂-硅藻土=1:2（w/w），薄層展開劑為石油醚-丙酮=17:4。

圖2可知，枸杞色素主要類型有黃色素、紅色素和綠色素，皂化后剩下黃色素和紅色素，綠色素消失由圖4可知其紫外可見光譜都呈相似的“三指狀”（three-peak spectrum）。在可見光區有吸收峰表明分子中有共軛雙鍵，光譜區在350～550nm之間，最高峰和次高峰分別為445.0nm及472.4nm，這是類胡蘿卜素的典型圖譜。因此，展開劑選用石油醚-丙酮=17:4（v/v），對枸杞色素提取液、枸杞總類胡蘿卜素樣品的分離效果很好，并且經多次試驗驗證，這種分離純化方法重復性好、穩定可靠、可滿足精細分離和樣品制備的需要。

圖2 枸杞類胡蘿卜素的薄層層析分離純化效果溶劑:石油醚（60～90℃）Fig.2 Separation and purification of separation and purification of chinensiscarotenoids from Lycium chinensis by thin-layer chromatography(TLC)

圖3 枸杞色素提取物的紫外可見光譜溶劑:石油醚（60～90℃）Fig.3 UV-VIS spectrum of pigment extracts of Lycium chinensis

圖4 枸杞色素非皂化物的紫外可見光譜溶劑:石油醚（60～90℃）Fig.4 UV-VIS spectrum of unsaponifiable matter of pigment extracts of Lycium chinensis

3 結論

1）對枸杞類胡蘿卜素的浸提條件進行了研究。得到的最佳參數是：浸提液為石油醚-丙酮（1:3，v/v）混合溶劑，料液比為90（g/mL），在常溫下分3次浸提，總浸提時間為1.5h。枸杞總類胡蘿卜素的含量為552.57mg/kg，在此條件下其總類胡蘿卜素的提取率可達95.5%。

2）對分離效果的研究。洗脫劑選擇正己烷-丙酮=90:10（v/v），吸附劑選擇為氧化鎂-硅藻土=1:2（w/w）；薄層展開劑選擇為石油醚-丙酮=17:4，此條件下對枸杞色素提取液、枸杞總類胡蘿卜素樣品有很好的分離效果。

[1]吉宏武,施兆鵬.HPLC分離測定紅心薯中類胡蘿卜素[J].無錫輕工大學學報,2001,20(3):299-301.

[2]王強,韓雅珊,廣田才之,等.食品中多種類胡蘿卜素的測定（HPLC法）[J].營養學報，1997，19（2）：212-215.

[3]劉大川,王靜.紫（白）蘇葉類胡蘿卜素提取工藝的研究[J].中國糧油學報,2002,17(1):54-58.

[4]李赫,陳敏,馬文平,等.不同成熟期枸杞中類胡蘿卜素含量的變化規律[J].中國農業科學,2006,39(3):599-605.

[5]王業勤,李勤生.天然類胡蘿卜素-研究進展、生產、應用[M].北京:中國醫藥科技出版社,1997.