MR-1通過抑制PERK/Nrf2途徑減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡*

陶天琪，王曉礽，徐菲菲，劉蜜，李玉珍，劉秀華

(中國人民解放軍總醫(yī)院病理生理研究室，北京 100853)

·論著·

MR-1通過抑制PERK/Nrf2途徑減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡*

陶天琪，王曉礽，徐菲菲，劉蜜，李玉珍，劉秀華△

(中國人民解放軍總醫(yī)院病理生理研究室，北京 100853)

目的:研究肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1(MR-1)是否通過抑制蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)途徑減輕缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。方法：在原代培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞H/R模型上，采用Annexin V/PI雙標法檢測心肌細胞的凋亡率;以Western blotting檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (GRP78)、磷酸化PERK、Nrf2、活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Bcl-2和Bax的蛋白水平，研究過表達或敲低對于H/R致心肌細胞凋亡的影響及其與PERK/Nrf2途徑活化的關(guān)系。結(jié)果:H/R引起心肌細胞凋亡;過表達MR-1減輕H/R引起的細胞凋亡(P＜0.01)，下調(diào)CHOP表達(P＜0.05)，引起B(yǎng)cl-2/Bax值升高(P＜0.01)，并抑制H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化、Nrf2核轉(zhuǎn)位和ATF4表達(P＜0.01)。敲低MR-1加重H/R引起的細胞凋亡(P＜0.01)、CHOP表達上調(diào)(P＜0.05)和Bcl-2/Bax值下降(P＜0.01)，并加重H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化(P＜0.05)、Nrf2核轉(zhuǎn)位和ATF4表達(P＜0.01)。結(jié)論:MR-1通過抑制PERK/Nrf2途徑而減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

細胞凋亡;缺氧/復(fù)氧;心肌細胞;肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1;蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)激酶;核因子E2相關(guān)因子2

缺血性疾病是嚴重危害人類健康的常見病［6］，盡早恢復(fù)組織血供是防治缺血損傷最有效的措施。但缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷所致的心肌細胞凋亡、壞死、惡性心律失常和心功能障礙嚴重影響再灌注療法療效和患者預(yù)后，是心血管領(lǐng)域亟待解決的重大問題。其中再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡是造成心肌梗死面積擴展、心功能障礙的重要因素，闡明調(diào)控心肌細胞凋亡的機制將為缺血再灌注的防治提供新靶點［1］。肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1(myofibrillogenesis regulator 1，MR-1)是課題組從人類骨骼肌cDNA文庫克隆出的人類新功能基因(AF417001)，定位于人類染色體2q35，mRNA全長755 bp，編碼一段142個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在心肌、骨骼肌、腎臟和肝臟中高表達［2-4］。課題組前期工作證實，MR-1定位于心肌細胞漿的肌原纖維，缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)時心肌細胞MR-1表達下調(diào);過表達MR-1明顯減輕H/R導(dǎo)致的腎小管上皮細胞凋亡，提示MR-1具有抗細胞凋亡的作用，其機制尚待闡明。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細胞應(yīng)激的最初反應(yīng)，可以整合并啟動線粒體和細胞核反應(yīng)，過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡主要通過蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)介導(dǎo)的C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)途徑、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)介導(dǎo)的caspase-12［5］和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)［6］途徑所介導(dǎo)。其中PERK通過激活真核細胞起始因子2(eukaryotic initiator factor 2α，eIF2α)上調(diào)活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，增加CHOP的表達，導(dǎo)致抑凋亡因子Bcl-2蛋白下調(diào)和促凋亡因子Bax蛋白上調(diào)，引起細胞凋亡［7］。我們既往的工作證實H/R誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生嚴重的ERS反應(yīng)，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和PERK表達上調(diào)，ERS相關(guān)細胞凋亡分子CHOP及其下游分子Bcl-2表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)［8-9］，提示PERK途徑是介導(dǎo)H/R誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的重要信號途徑。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)在生理狀態(tài)下位于細胞漿內(nèi)的細胞骨架。既往研究證實I/R誘導(dǎo)Nrf2胞核轉(zhuǎn)位，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements，AREs)相關(guān)靶基因的啟動子結(jié)合，促使抗氧化蛋白及酶類如NAD(P)H的基因轉(zhuǎn)錄增加，減輕氧化反應(yīng)［10］。最近發(fā)現(xiàn)，Nrf2還是PERK的下游底物［6］，I/R誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)位的Nrf2在細胞核內(nèi)大量聚集［10］，通過作用于ATF4啟動子，上調(diào)ATF4的轉(zhuǎn)錄水平［11］，從而正反饋調(diào)節(jié)PERK途徑凋亡相關(guān)分子ATF4，提示PERK介導(dǎo)的Nrf2/ATF4相關(guān)信號途徑可能是I/R誘導(dǎo)細胞凋亡的重要機制。本工作以體外培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞缺氧8 h/復(fù)氧16 h模型模擬在體心肌I/R誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，分別以腺病毒感染過表達和穩(wěn)定型小干擾RNA(stealth siRNA，st-RNA)轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低MR-1表達，研究其對H/ R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和PERK介導(dǎo)的Nrf2/ATF4信號途徑的影響，旨在證實MR-1通過抑制PERK介導(dǎo)的Nrf2/ATF4相關(guān)信號途徑減輕H/R導(dǎo)致的心肌細胞細胞凋亡，為心肌I/R的防治提供新途徑。

材料和方法

1 動物與試劑

清潔級SD乳鼠(出生24 h內(nèi))購自北京市軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco;新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、蛋白酶抑制劑和Triton X-100購自Sigma;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Direction Kit)購自南京凱基生物工程公司;蛋白電泳分子量(7～175 kD)標記為Bio-Rad產(chǎn)品;蛋白定量試劑盒購自康威世紀公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen;兔抗人GRP78、PERK、Bcl-2、Bax多克隆抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體和小鼠抗人CHOP單克隆抗體購自Cell Signaling Technology;兔抗人磷酸化PERK(p-PERK)、ATF4和Nrf2多克隆抗體，Texas red-conjugated驢抗兔抗體，增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自Santa Cruz;辣根過氧化酶標記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購自Epitomics;胞漿胞核蛋白分離提取試劑盒購自Thermo Fisher Scientific;含DAPI的抗淬滅封片劑購自Vector Laboratories;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自Merck;其余化學試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2 乳鼠心肌細胞培養(yǎng)與分組

按我們報道的方法［12］培養(yǎng)乳鼠心肌細胞:出生24 h內(nèi)乳大鼠常規(guī)消毒后無菌操作取出心尖部組織，立即在4℃無菌磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)中洗去殘血，分離附著組織后，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，經(jīng)0.15%胰蛋白酶37℃反復(fù)消化，制備心肌細胞懸液，用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成細胞密度為3×109/L，接種于75 mm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5% CO2孵箱中進行原代培養(yǎng)。實驗前24 h更換無血清DMEM培養(yǎng)基，進行同步化處理后，隨機分為以下7 組:(1)正常對照組(control):正常連續(xù)培養(yǎng)48 h; (2)缺氧/復(fù)氧組(H/R):心肌細胞置于三氣培養(yǎng)箱缺氧8 h(37℃，O2含量5%，N2含量90%，CO2含量5%)，后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧培養(yǎng)16 h結(jié)束實驗;(3)MR-1過表達組(Ad-MR-1):以構(gòu)建的MR-1重組腺病毒Ad-MR-1感染細胞，使感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI;即:加入病毒總數(shù)/細胞總數(shù))為50 pfu，感染48 h后結(jié)束實驗;(4) MR-1敲低組(st-MR-1):針對rat MR-1(NM_ 001134753.1)設(shè)計并篩選出25 bp的st-RNA，以50 nmol/L轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染方法見下述，轉(zhuǎn)染5 h后更換有血清DMEM培養(yǎng)液;(5)MR-1過表達+缺氧/復(fù)氧組(Ad-MR-1+H/R):按照(3)組方法以Ad-MR-1感染細胞20 h后更換無血清DMEM，再按照(2)組程序操作;(6)MR-1敲低+缺氧/復(fù)氧組(st-MR-1 +H/R):按照(4)組方法轉(zhuǎn)染st-MR-1，轉(zhuǎn)染后20 h更換無血清DMEM，再按照(2)組程序操作;(7)隨機25 bp雙鏈RNA轉(zhuǎn)染對照組(mock):隨機合成25 bp且GC含量與st-MR-1一致的雙鏈st-RNA，按照(4)組方法轉(zhuǎn)染操作。

3 腺病毒的包裝與感染

按照文獻報道方法從質(zhì)粒pcDNA3.1-hMR-1［13］中擴增目的基因MR-1，委托Invitrogen公司構(gòu)建包裝含有MR-1全長的重組腺病毒Ad-MR-1，結(jié)果測定病毒滴度為3.3×1012pfu/L。以該病毒原液感染生長至對數(shù)期的細胞，感染前更換有血清的DMEM培養(yǎng)液，每1×105個細胞約加入病毒液10 μL，使感染復(fù)數(shù)約為50 pfu，感染48 h后結(jié)束實驗。

4 st-RNA的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

針對rat MR-1(NM_001134753.1)設(shè)計并篩選出25bp的st-RNA(st-MR-1)，序列為5’-CGACAGCUAACAAGGCUUCCCAGAA-3’，以50 nmol/L轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamin 2000試劑盒說明書進行，轉(zhuǎn)染5 h后更換有血清DMEM培養(yǎng)液15 h后更換無血清DMEM培養(yǎng)液。

5 Annexin V/PI雙標法檢測細胞凋亡

培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞以1×104/cm2的密度接種于25 mm2培養(yǎng)皿，參照Annexin V-FITC Apoptosis Direction Kit說明書的方法進行檢測:實驗處理結(jié)束后以含EDTA的0.25%胰酶消化并收集細胞，以0.01 mol/L PBS離心洗滌細胞2次(3 000 r/min離心30 s)，洗滌后的沉淀以500 μL Binding Buffer懸浮均勻，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混合均勻，室溫下避光孵育10 min后，流式細胞術(shù)檢測早期凋亡率和晚期凋亡率之和。

6 Nrf2細胞熒光染色

細胞以1×104/cm2的密度接種于包被有明膠的蓋玻片，實驗處理后以PBS洗滌3次，-20℃預(yù)冷的冰甲醇預(yù)固定5 min，4%多聚甲醛固定15 min，以含有0.1%Triton X-100、含1%BSA的PBS在室溫下封閉50 min，以1%BSA配制Ⅰ抗工作液:多克隆兔抗人Nrf2(1∶40)，室溫下Ⅰ抗工作液孵育1 h，PBS洗滌10 min×3次，以PBS配制Ⅱ抗工作液: Texas red-conjugated驢抗兔(1∶200)。Ⅱ抗工作液于室溫下避光孵育1 h，以PBS洗滌10 min×3次，用含DAPI的抗淬滅封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM-510 Meta)觀察并采集圖像。

7 Nrf2胞漿胞核蛋白分離與蛋白定量

按照胞漿胞核蛋白分離提取試劑盒的操作步驟進行，以BCA法進行蛋白定量。

8 免疫印跡法

取含有80 μg蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后以半干式法電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，0.01mol/L TBST(20 mmol/L Tris-HCl，137 mmol/L NaCl，0.01%Tween-20，pH 7.5)配制的5%BSA室溫封閉，加入Ⅰ抗于4℃過夜雜交，不同抗體的稀釋度分別為:anti Bcl-2(1∶1 000)，anti Bax(1∶1 000)，anti CHOP(1∶500)，anti ATF4(1∶200)，anti Nrf2 (1∶100)，antip-PERK(1∶500)，antiPERK (1∶1 000)，anti GRP78(1∶500)，anti GAPDH (1∶1 000);加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(TBST配制，1∶1 000)，室溫作用2 h后以ECL試劑盒發(fā)光顯影。以圖像分析軟件Image-Pro Plus測量各組條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA;IA=mean absorbance×area)進行半定量分析，并與內(nèi)參照GAPDH的IA值進行比較。

9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)進行組間比較，采用q檢驗進行兩兩比較;對胞核Nrf2蛋白量與ATF4蛋白量進行相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 MR-1減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的結(jié)果見圖1。缺氧8 h/復(fù)氧16 h(H/R組)心肌細胞凋亡率較正常對照組高［(12.1±2.2)%vs(6.3±1.1)%，P＜0.01］。與正常對照組比較，重組腺病毒Ad-MR-1感染心肌細胞48 h致MR-1過表達的Ad-MR-1組細胞凋亡率無明顯改變(P＞0.05);但MR-1過表達明顯抑制心肌細胞H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡增加［(9.1 ±1.5)%vs(12.1±2.2)%，P＜0.01］。以st-RNA敲低MR-1表達后誘導(dǎo)心肌細胞凋亡［(15.9± 2.1)%vs(12.0±1.1)%，P＜0.01］;與單純H/R組比較，MR-1敲低加重H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡［(17.2±0.8)%vs(12.1±2.2)%，P＜0.01］。上述結(jié)果提示MR-1具有抑制H/R誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的作用。

Figure 1.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation(H/R)in vitro as determined by flow cytometric analysis of Annexin V and propidium iodide(PI)double-stained cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖1 Annexin V/PI雙染的流式細胞術(shù)分析MR-1對H/R誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的影響

2 MR-1減輕H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)細胞凋亡

Western blotting檢測心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78的結(jié)果見圖2。與正常對照組比較，H/ R組GRP78蛋白表達高1.1倍(P＜0.01)，提示H/R可誘導(dǎo)心肌細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Ad-MR-1組GRP78蛋白表達較正常對照組高1倍(P＜0.01)，與H/R組無顯著差異(P＞0.05)，但是MR-1過表達減輕了H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78蛋白表達，表現(xiàn)為Ad-MR-1+H/R組GRP78蛋白表達較H/R組低14.2%(P＜0.01)，提示單純過表達MR-1可產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而MR-1過表達減輕了H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。Mock組GRP78蛋白表達較正常對照組高61.7%(P＜0.01)，而敲低MR-1(st-MR-1 組)GRP78蛋白表達較Mock組高21.2%(P＜0.01);敲低MR-1的心肌細胞在H/R后(st-MR-1+H/R組) GRP78蛋白表達較H/R組高5.6%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并進一步加重H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

Figure 2.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the expression of GRP78 in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖2 MR-1對H/R心肌細胞GRP78蛋白表達的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡分子CHOP表達的檢測結(jié)果見圖3。與正常對照組比較，H/R組CHOP蛋白表達高16.0%(P＜0.01)，提示H/R可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡;單純過表達MR-1對CHOP蛋白表達無明顯影響(P＞0.05)，但是過表達MR-1卻減少H/R誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達，表現(xiàn)為CHOP蛋白表達較H/R組低9.9%(P＜0.05)，提示MR-1過表達明顯抑制H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡。Mock組心肌細胞CHOP蛋白表達較正常對照組高14.2%(P＜0.01);與mock組比較，st-MR-1組心肌細胞CHOP蛋白表達高8.6%(P＜0.01);敲低MR-1的心肌細胞行H/R后CHOP蛋白表達較H/R組高5.1%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細胞凋亡，并進一步加重H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細胞凋亡。

Figure 3.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of ERS-related apoptotic protein CHOP in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖3 MR-1對H/R心肌細胞CHOP蛋白表達的影響

進一步分析CHOP下游促凋亡因子Bax蛋白和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達的結(jié)果見圖4。與正常對照組比較，H/R組抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達低20.6%，促凋亡因子Bax蛋白表達高18.9%，Bcl-2/ Bax值低33.2%(P＜0.01)，提示H/R誘導(dǎo)心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡的CHOP途徑活化。單純過表達MR-1的Ad-MR-1組Bcl-2和Bax蛋白表達無顯著差異(P＞0.05)，但卻明顯影響H/R誘導(dǎo)的CHOP下游促凋亡因子Bax蛋白和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達。與H/R組比較，Ad-MR-1+H/R組Bcl-2蛋白表達高29.3%，Bax蛋白表達低15.9%，Bcl-2/Bax值高53.7%(P＜0.01)，提示MR-1過表達可以減輕H/R誘導(dǎo)的CHOP凋亡途徑活化。與正常對照組比較，mock組Bcl-2和Bax蛋白表達分別高23.4%和20.8%，Bcl-2/Bax值低15.2%(P＜0.01)，st-MR-1組Bcl-2和Bax蛋白表達較mock組分別低41.0%和18.8%(P＜0.05)，但Bcl-2/Bax值低27.3%(P＜0.01);敲低MR-1進一步加重H/ R誘導(dǎo)的Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào)，表現(xiàn)為與H/R組比較，st-MR-1+H/R組心肌細胞Bcl-2蛋白表達降低25.4%，Bax蛋白表達增高26.2%，Bcl-2/Bax值降低28.8%(P＜0.01)，提示敲低MR-1本身可以誘導(dǎo)CHOP凋亡途徑活化，并進一步加重H/R誘導(dǎo)的CHOP凋亡途徑活化。

Figure 4.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and proapoptotic protein Bax，and Bcl-2/Bax ratio in H/R-induced cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖4 MR-1對H/R心肌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax值的影響

3 MR-1通過PERK/Nrf2途徑減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡

3.1 MR-1抑制H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化Western blotting檢測心肌細胞PERK表達與磷酸化的結(jié)果見圖5。H/R明顯上調(diào)PERK表達及其磷酸化，其PERK蛋白表達和磷酸化水平分別較正常對照組高24.6%和100%(P＜0.01)，提示H/R上調(diào)PERK蛋白表達和磷酸化，其中磷酸化上調(diào)更為明顯。單純過表達MR-1的Ad-MR-1組PERK蛋白表達和磷酸化水平較正常對照組無顯著差異(P＞0.05);而過表達MR-1后行H/R的心肌細胞，盡管其PERK蛋白表達較H/R組高18.5%(P＜0.05)，卻明顯下調(diào)PERK磷酸化水平，其PERK磷酸化水平較H/R組低56.5%(P＜0.01)，提示單純過表達MR-1對PERK的蛋白表達和磷酸化無明顯影響，但明顯抑制H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化上調(diào)。與正常對照組比較，mock組PERK蛋白表達無顯著差異(P＞0.05)，但其磷酸化水平高22.1%(P＜0.01);與mock組比較，單純敲低MR-1的st-MR-1組PERK蛋白表達和磷酸化水平分別高17.7%和35.0%(P＜0.01)，而與H/R組比較，敲低MR-1的心肌細胞在H/R后其PERK蛋白表達無明顯改變(P＞0.05)，但PERK磷酸化水平高2.5%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導(dǎo)PERK磷酸化，并進一步上調(diào)H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化。

Figure 5.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the phosphorylation of PERK in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖5 MR-1對H/R心肌細胞PERK磷酸化的影響

3.2 MR-1抑制H/R誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位采用細胞免疫熒光染色檢測PERK下游分子Nrf2亞細胞分布的結(jié)果見圖6A。正常對照組Nrf2蛋白主要均勻分布于胞漿，胞核內(nèi)少量均勻分布。與正常對照組比較，H/R組心肌細胞內(nèi)Nrf2出現(xiàn)明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，Nrf2主要集聚在細胞核內(nèi)和核周，且在核內(nèi)呈團塊狀分布;單純過表達MR-1對Nrf2亞細胞分布無明顯影響，表現(xiàn)為Ad-MR-1組Nrf2在心肌細胞胞漿內(nèi)均勻分布，少量均勻分布在核內(nèi)，與正常對照組類似;但過表達MR-1明顯減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞Nrf2核轉(zhuǎn)位，表現(xiàn)為Ad-MR-1+H/R組心肌細胞內(nèi)Nrf2均勻分布于胞漿，少量Nrf2均勻分布于核內(nèi);與正常對照組比較，mock組Nrf2在胞漿和胞核內(nèi)均勻分布，但在少數(shù)細胞的核內(nèi)呈團塊狀分布;與mock組比較，敲低MR-1后心肌細胞Nrf2集中分布在核內(nèi)和核周，提示敲低MR-1可以造成Nrf2核轉(zhuǎn)位，且敲低MR-1進一步加重H/R誘導(dǎo)的心肌細胞Nrf2核轉(zhuǎn)位，表現(xiàn)為st-MR-1+H/R組心肌細胞內(nèi)Nrf2團塊狀積聚于胞核內(nèi)和核周，極少量分布于胞漿。上述結(jié)果表明，H/R造成Nrf2核轉(zhuǎn)位，過表達MR-1明顯減輕H/R誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位，敲低MR-1加重H/R誘導(dǎo)的心肌細胞Nrf2核轉(zhuǎn)位。

Western blotting檢測Nrf2胞漿與胞核組分蛋白的結(jié)果見圖6B、C。正常對照組心肌細胞胞漿和胞核中均存在Nrf2蛋白。H/R組Nrf2胞核組分蛋白較正常對照組高47.9%(P＜0.01)，胞漿組分蛋白無明顯改變(P＞0.05)，提示H/R增加Nrf2蛋白的表達并誘導(dǎo)其核轉(zhuǎn)位。單純過表達MR-1對心肌細胞Nrf2胞核組分蛋白無明顯影響(P＞0.05)，但胞漿組分蛋白較正常對照組高32.5%(P＜0.01);與H/R組比較，過表達MR-1后行H/R的心肌細胞，盡管其胞漿組分蛋白較H/R組高1.2倍，但是明顯減少了H/R誘導(dǎo)的Nrf2胞核組分蛋白上調(diào)，其Nrf2胞核組分蛋白較H/R低30.6%(P＜0.01)，提示過表達MR-1增加Nrf2蛋白在胞漿的分布，但抑制H/R誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位。與正常對照組比較，mock組的Nrf2胞核和胞漿組分均升高，表現(xiàn)為胞核組分蛋白高31.4%，胞漿組分蛋白高25.7%(P＜0.01);與mock組比較，敲低MR-1僅引起Nrf2胞核組分蛋白上調(diào)，表現(xiàn)為Nrf2胞核組分蛋白高18.5%(P＜0.01)，胞漿組分無顯著差異(P＞0.05);敲低MR-1進一步加重H/R誘導(dǎo)的心肌細胞Nrf2胞核組分蛋白上調(diào)，表現(xiàn)為st-MR-1+H/R組心肌細胞核Nrf2蛋白較H/R組高36.1%(P＜0.01)，但對胞漿組分無明顯影響(P＞0.05)，提示敲低MR-1進一步上調(diào)H/R誘導(dǎo)的Nrf2胞核組分蛋白，加重H/R誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位。

3.3 MR-1抑制H/R誘導(dǎo)的Nrf2下游分子ATF4表達上調(diào)Western blotting檢測Nrf2的下游分子ATF4表達的結(jié)果見圖7。與正常對照組比較，H/R 組ATF4蛋白表達高51.6%(P＜0.01)，提示H/R可通過激活PERK途徑導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡。過表達MR-1對ATF4蛋白表達無明顯影響(P＞0.05)，卻明顯抑制H/R誘導(dǎo)的ATF4蛋白表達，表現(xiàn)為Ad-MR-1+H/R組ATF4蛋白表達較H/R組低17.7%(P＜0.01)，提示MR-1過表達通過抑制PERK途徑的激活減輕H/R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡。Mock組的ATF4蛋白表達較正常對照組高19.9%(P＜0.01)，但st-MR-1組ATF4蛋白表達較mock組高42.4%(P＜0.01);敲低MR-1可加重H/R誘導(dǎo)的ATF4蛋白表達，表現(xiàn)為st-MR-1 +H/R組較H/R組高27.4%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以激活PERK途徑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡，并通過進一步激活PERK途徑加重H/ R誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡。

Figure 6.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the nuclear translocation of Nrf2 in H/R-treated cardiomyocytes.A:Nrf2 immunofluorescence assay and DAPI staining under laser scanning confocal microscope (×600);B，C:the levels of nuclear Nrf2 protein and cytoplasmic Nrf2 protein examined by Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖6 MR-1對H/R心肌細胞Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位的影響

Figure 7.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of ATF4 in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖7 MR-1對H/R心肌細胞ATF4蛋白表達的影響

3.4 Nrf2胞核組分蛋白與ATF4蛋白表達的相關(guān)分析相關(guān)分析顯示，Nrf2胞核組分蛋白與ATF4蛋白表達呈顯著正相關(guān)(r=0.935，P＜0.01)。

討論

I/R損傷指缺血一定時間的心肌恢復(fù)灌流后，組織損傷反而進行性加重，心肌細胞從可逆損傷轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡鎿p傷的現(xiàn)象。心肌細胞凋亡和壞死是心肌再灌注損傷的特征之一［14］。減輕心肌細胞凋亡是減輕心肌細胞I/R損傷的關(guān)鍵途徑。心肌細胞H/R可在一定程度上模擬心肌缺血再灌注損傷，研究證實H/R可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡［8-9］。MR-1是一種從人類骨骼肌cDNA文庫克隆出的新功能基因，在心肌、骨骼肌、腎臟和肝臟中高表達［2-4］。本研究首次證實了MR-1通過減輕PERK磷酸化降低H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，對H/R的心肌細胞具有保護作用。

前期工作證實，過表達MR-1明顯減輕H/R誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡，提示MR-1可能具有抗細胞凋亡的作用。本研究在新生SD乳鼠心肌細胞H/ R模型上，采用Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)的方法，證實了H/R誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，表現(xiàn)為H/ R組細胞凋亡率較正常對照組高，與文獻報道一致［15］。MR-1在心肌細胞中有生理性表達［2-4］，定位于心肌細胞漿的肌原纖維，H/R時心肌細胞MR-1表達下調(diào)。本研究證實MR-1減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。我們以缺氧8 h/復(fù)氧16 h處理心肌細胞模擬在體的心肌I/R損傷，發(fā)現(xiàn)H/R誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細胞凋亡。我們以含有MR-1全長的重組腺病毒感染心肌細胞，發(fā)現(xiàn)過表達MR-1對細胞凋亡率較正常對照組無明顯改變，但MR-1過表達明顯抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。相反，以st-RNA轉(zhuǎn)染心肌細胞以抑制MR-1的表達，發(fā)現(xiàn)敲低MR-1可引起心肌細胞凋亡率的升高，且敲低MR-1加重H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡率。

H/R所致的心肌細胞凋亡機制尚未完全闡明。近年來，ERS相關(guān)細胞凋亡在心肌細胞凋亡的發(fā)病機制中的作用越來越受到重視。ERS是細胞對內(nèi)外刺激的適應(yīng)性反應(yīng)。適度ERS誘導(dǎo)GRP78等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子表達上調(diào)，有利于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，并促進鈣穩(wěn)態(tài)的恢復(fù);持續(xù)而嚴重的ERS可明顯上調(diào)GRP78的表達，誘導(dǎo)ERS相關(guān)的促凋亡因子CHOP的表達及活化，觸發(fā)ERS相關(guān)凋亡途徑［6］。CHOP是過度ERS誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵分子，可直接下調(diào)Bcl-2的表達，導(dǎo)致Bax從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體，促進細胞凋亡［16］。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡。Bax形成同源二聚體時誘導(dǎo)細胞凋亡，Bax與Bcl-2形成異源二聚體時抑制細胞凋亡［17］。Bcl-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體(Bcl-2/Bax)與同二聚體(Bax/ Bax)的比值，故細胞凋亡的發(fā)生取決于Bcl-2和Bax的相對濃度，即Bcl-2/Bax值［18］。在正常培養(yǎng)的心肌細胞中，GRP78、CHOP、Bcl-2和Bax均有生理性表達，我們以H/R處理心肌細胞，發(fā)現(xiàn)H/R誘導(dǎo)心肌細胞產(chǎn)生ERS相關(guān)的細胞凋亡，GRP78、CHOP和Bax表達均高于正常對照組，Bcl-2表達和Bcl-2/Bax值則均低于正常對照組。過表達MR-1可引起適度ERS，但沒有引起ERS相關(guān)細胞凋亡，表現(xiàn)為GRP78表達較正常對照組高，但對細胞凋亡率及凋亡相關(guān)分子的表達無明顯影響;過表達MR-1明顯減輕H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)心肌細胞凋亡，表現(xiàn)為較H/R組GRP78、CHOP和Bax蛋白表達更低，Bcl-2蛋白表達更高，Bcl-2/Bax值更高;敲低MR-1可產(chǎn)生ERS相關(guān)心肌細胞凋亡，表現(xiàn)為較mock組GRP78和CHOP蛋白表達高，Bcl-2/Bax值低;且MR-1敲低后H/R較單純H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)細胞凋亡更為嚴重，表現(xiàn)為較H/R組GRP78、CHOP和Bax蛋白表達更高，Bcl-2蛋白表達更低，Bcl-2/Bax比值更低。上述結(jié)果提示，MR-1可能作為一個重要的內(nèi)源性保護分子，在減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞ERS相關(guān)凋亡中發(fā)揮重要作用。

PERK是介導(dǎo)ERS相關(guān)細胞凋亡的重要感受分子。生理狀態(tài)下，PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)分子GRP78結(jié)合，以無活性復(fù)合物的形式存在［19］。未折疊蛋白增多時，GRP78與未折疊蛋白結(jié)合而與PERK解離。解離后的PERK發(fā)生自身磷酸化而被激活，進一步磷酸化其下游底物eIF2α，選擇性上調(diào)ATF4。長期過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，ATF4上調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致ERS相關(guān)細胞凋亡［20］。我們前期研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，H/R誘導(dǎo)的PERK磷酸化水平、PERK下游信號分子ATF4和CHOP的表達更高，提示H/R誘導(dǎo)PERK介導(dǎo)的ERS相關(guān)細胞凋亡［8-9］。Nrf2生理狀態(tài)時位于細胞漿內(nèi)的細胞骨架，與其抑制蛋白Keap1結(jié)合，處于非游離、非活性狀態(tài)。當I/ R誘導(dǎo)Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，作用于AREs的相關(guān)序列，激活相關(guān)靶基因，繼而啟動下游抗氧化蛋白及酶類的基因轉(zhuǎn)錄，提高細胞抗氧化應(yīng)激能力［10］。近期研究證實Nrf2是位于PERK下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，PERK磷酸化激活Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位［6］，Nrf2的胞核組分蛋白可能作用于ATF4啟動子，上調(diào)ATF4的轉(zhuǎn)錄水平［11］，并進一步上調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致ERS相關(guān)細胞凋亡［20］。根據(jù)文獻報道，將人視網(wǎng)膜色素上皮細胞敲低Nrf2后行缺氧處理，ATF4的表達較缺氧組明顯降低。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示Nrf2作用于ATF4啟動子，且過表達Nrf2激活A(yù)TF4啟動子，促進ATF4的轉(zhuǎn)錄［11］。此外，敲低內(nèi)皮細胞的Nrf2后行氧化磷脂處理，亦可顯著降低ATF4表達［21］。根據(jù)文獻推斷，細胞凋亡可通過內(nèi)外因素激活PERK/Nrf2核轉(zhuǎn)位/ATF4/CHOP途徑發(fā)生。

本研究證實，在正常培養(yǎng)的心肌細胞中，Nrf2存在于胞核和胞漿內(nèi)，但以胞漿內(nèi)分布為主，PERK、ATF4和CHOP均有生理性表達。我們以H/R處理心肌細胞，發(fā)現(xiàn)H/R誘導(dǎo)心肌細胞PERK磷酸化，引起Nrf2核轉(zhuǎn)位，上調(diào)ATF4的表達，進而上調(diào)CHOP的表達。同時，雖然過表達MR-1對PERK途徑無明顯影響，表現(xiàn)為PERK磷酸化及下游信號分子的蛋白表達無明顯變化，但是過表達MR-1后行H/R處理，可下調(diào)H/R誘導(dǎo)的心肌細胞PERK磷酸化，減少Nrf2核轉(zhuǎn)位，下調(diào)ATF4和CHOP的蛋白表達，提示過表達MR-1可通過減輕H/R對PERK途徑的激活，減輕H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)細胞凋亡。此外，敲低MR-1可誘導(dǎo)PERK磷酸化介導(dǎo)的ERS相關(guān)細胞凋亡，表現(xiàn)為PERK磷酸化高于MOCK組，Nrf2核轉(zhuǎn)位較mock組更明顯，ATF4和CHOP蛋白表達較mock組高;敲低MR-1后行H/R處理可通過進一步激活H/R誘導(dǎo)的PERK途徑，進而加重H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)細胞凋亡，表現(xiàn)為PERK磷酸化較H/R組高，Nrf2核轉(zhuǎn)位較H/R組更明顯，ATF4和CHOP蛋白表達較H/R組高。在此基礎(chǔ)上對ATF4蛋白表達和胞核Nrf2蛋白之間進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ATF4蛋白表達與Nrf2胞核組分蛋白呈正相關(guān)，提示Nrf2核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)的凋亡信號途徑可能通過促進ATF4蛋白表達引起細胞凋亡。

另有文獻報道，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和ATF4具有相似的靶基因，存在協(xié)同和拮抗作用。兩者可直接誘導(dǎo)AREs相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［22］，但也可直接作用于CHOP啟動子，ATF4促進CHOP轉(zhuǎn)錄，Nrf2抑制CHOP轉(zhuǎn)錄［23］。此外，Nrf2也可通過解除ATF4與CHOP的結(jié)合，進而抑制CHOP轉(zhuǎn)錄［24］。根據(jù)研究結(jié)果推斷，我們認為在H/R引起心肌細胞PERK介導(dǎo)的ERS相關(guān)細胞凋亡的過程中，Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，促進ATF4的表達。雖然Nrf2可直接或間接下調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄，但是ATF4上調(diào)促進CHOP的表達增加起主要作用。這提示H/R通過PERK介導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位/ATF4/CHOP途徑誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，而MR-1通過抑制上述途徑減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

綜上所述，我們認為MR-1通過抑制過度ERS發(fā)揮減輕心肌H/R損傷的作用，表現(xiàn)為降低H/R誘導(dǎo)的GRP78蛋白表達，抑制PERK介導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位/ATF4/CHOP途徑，減輕H/R誘導(dǎo)的ERS相關(guān)細胞凋亡。但MR-1對在體大鼠心肌I/R損傷的心肌保護作用尚待進一步研究。

［1］劉秀華，唐朝樞.缺血再灌注損傷的防治——從實驗室到臨床［J］.中華心血管病雜志，2006，34(8):677-679.

［2］Li TB，Liu XH，F(xiàn)eng S，et al.Characterization of MR-1，a novel myofibrillogenesis regulator in human muscle［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2004，36(6):412-418.

［3］徐菲菲，劉秀華，王彥珍，等.肌原纖維調(diào)節(jié)因子-1在心肌肥大中的作用研究［J］.中國病理生理雜志，2006，22(3):443-447.

［4］王曉礽，劉秀華，宋泉聲，等.人肌纖生成調(diào)節(jié)因子-1抗體的制備、鑒定及其在乳鼠心肌細胞中的應(yīng)用［J］.中國病理生理雜志，2010，26(1):42-47.

［5］Kim EM，Shin EJ，Choi JH，et al.Matrix metalloproteinase-3 is increased and participates in neuronal apoptoticsignaling downstream of caspase-12 during endoplasmic reticulum stress［J］.J Biol Chem，2010，285(22):16444-16452.

［6］Hetz C.The unfolded protein response:controlling cell fate decisions under ER stress and beyond［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13(2):89-102.

［7］Pahl HL.Signal transduction from the endoplasmic reticulum to the cell nucleus［J］.Physiol Rev，1999，79(3): 683-701.

［8］徐菲菲.鈣網(wǎng)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡參與心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷［D］.北京:中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院，2009.

［9］王琛，李玉珍，王曉礽，等.西洋參莖葉總皂苷通過抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕大鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷［J］.中國病理生理雜志，2012，28(1):22-28.

［10］Leonard MO，Kieran NE，Howell K，et al.Reoxygenation-specific activation of the antioxidant transcription factor Nrf2 mediates cytoprotective gene expression in ischemia-reperfusion injury［J］.FASEB J，2006，20(14): 2624-2626.

［11］Miyamoto N，Izumi H，Miyamoto R，et al.Transcriptional regulation of activating transcription factor 4 under oxidative stress in retinal pigment epithelial ARPE-19/HPV-16 cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(3):1226-1234.

［12］Liu XH，Wu XD，Cai LR，et al.Hypoxic preconditioning of cardiomyocytes and cardioprotection:phosphorylation of HIF-1α induced by p42/p44 mitogen-activated protein kinases is involved［J］.Pathophysiology，2003，9(4):201-205.

［13］Wang X，Liu X，Wang S，et al.Myofibrillogenesis regulator 1 induces hypertrophy by promoting sarcomere organization in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Hypertens Res，2012，35(6):597-603.

［14］Fliss H，Gattinger D.Apoptosis in ischemic and reperfused rat myocardium［J］.Circ Res，1996，79(5):949-956.

［15］張峰，梅其芮，張濤，等.缺氧預(yù)適應(yīng)抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的作用及機制［J］.中國病理生理雜志，2005，21(2):351-355.

［16］McCullough KD，MartindaleJL，KlotzLO，etal.Gadd153 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl-2 and perturbing the cellular redox state［J］.Mol Cell Biol，2001，21(4):1249-1259.

［17］Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis［J］.Apoptosis，2007，12(5):887-896.

［18］王衛(wèi)東.Bcl-2/Bax比率與細胞“命運”［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2007，14(4):393-396.

［19］Bertolotti A，Zhang Y，Hendershot LM，et al.Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfoldedprotein response［J］.Nat Cell Biol，2000，2(6):326-332.

［20］Endo M，Oyadomari S，Suga M，et al.The ER stress pathway involving CHOP is activated in the lungs of LPS-treated mice［J］.J Biochem，2005，138(4):501-507.

［21］Afonyushkin T，Oskolkova OV，Philippova M，et al.Oxidized phospholipids regulate expression of ATF4and VEGF in endothelial cells via NRF2-dependent mechanism:novel point of convergence between electrophilic and unfolded protein stress pathways［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(5):1007-1013.

［22］He CH，Gong P，Hu B，et al.Identification of activating transcription factor 4(ATF4)as an Nrf2-interacting protein.Implication for heme oxygenase-1 gene regulation ［J］.J Biol Chem，2001，276(24):20858-20865.

［23］Cullinan SB，Diehl JA.PERK-dependent activation of Nrf2 contributes to redox homeostasis and cell survival following endoplasmic reticulum stress［J］.J Biol Chem，2004，279(19):20108-20117.

［24］Zong ZH，Du ZX，Li N，et al.Implication of Nrf2 and ATF4 in differential induction of CHOP by proteasome inhibition in thyroid cancer cells［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1823(8):1395-1404.

Myofibrillogenesis regulator 1 attenuates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis of cardiomyocytes by inhibiting PERK/Nrf2 pathway

TAO Tian-qi，WANG Xiao-reng，XU Fei-fei，LIU Mi，LI Yu-zhen，LIU Xiu-hua
(Department of Pathophysiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.E-mail:xiuhualiu98@163.com)

AIM:To investigate the effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced apoptosis of cardiomyocytes and to study the role of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK)/nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)pathway.METHODS:In the H/R model of primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes，the apoptosis was assessed by Annexin V/PI double staining.Western blotting was used to detect the protein levels of glucose-regulated protein 78(GRP78)，phosphorylated PERK，Nrf2，activating transcription factor 4 (ATF4)，C/EBP homologous protein(CHOP)，Bcl-2 and Bax.The effects of over-expression or knockdown of MR-1 on the apoptosis and the PERK/Nrf2 pathway were determined.RESULTS:H/R induced the apoptosis of cardiomyocytes.Compared with H/R group，MR-1 over-expression attenuated H/R-induced apoptosis(P＜0.01)，down-regulated CHOP expression(P＜0.05)，and increased Bcl-2/Bax ratio(P＜0.01).MR-1 over-expression suppressed H/R-induced PERK phosphorylation，Nrf2 nuclear translocation and ATF4 expression(P＜0.01).However，MR-1 knockdown aggravated H/R-induced apoptosis(P＜0.01)，up-regulated CHOP expression(P＜0.05)，and decreased Bcl-2/Bax ratio(P＜0.01).MR-1 knockdown up-regulated H/R-induced PERK phosphorylation(P＜0.05)，Nrf2 nuclear translocation and ATF4 expression(P＜0.01).CONCLUSION:MR-1 suppresses H/R-induced cardiomyocyte apoptosis by inhibiting PERK/Nrf2 pathway.

Apoptosis;Hypoxia/reoxygenation;Cardiomyocytes;Myofibrillogenesis regulator 1;Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;Nuclear factor E2-related factor 2

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.001

1000-4718(2014)02-0193-10

2013-10-15

2014-01-02

國家自然科學基金資助項目(No.81170140;No.81070130)

△通訊作者Tel:010-66939763;E-mail:xiuhualiu98@163.com