七葉皂苷鈉通過抑制Akt和ERK信號通路誘導HeLa細胞凋亡及對死亡受體表達的影響*

齊世美，戚之琳，凌烈鋒，呂俊，章堯

(皖南醫學院生物化學教研室，安徽蕪湖 241002)

七葉皂苷鈉通過抑制Akt和ERK信號通路誘導HeLa細胞凋亡及對死亡受體表達的影響*

齊世美，戚之琳，凌烈鋒，呂俊，章堯△

(皖南醫學院生物化學教研室，安徽蕪湖 241002)

目的:探討七葉皂苷鈉誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡的作用及其分子機制。方法：采用MTT法檢測七葉皂苷鈉對宮頸癌HeLa細胞的生長和增殖抑制作用;倒置顯微鏡觀察細胞形態改變;利用annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡率;采用DAPI單染法熒光顯微鏡下觀察細胞核變化情況;利用Western blotting檢測凋亡相關蛋白［聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、pro-caspase-3］和細胞存活相關信號通路(Akt、ERK)以及TRAIL受體(DR4、DR5)的變化情況。結果:七葉皂苷鈉以劑量依賴的方式顯著抑制宮頸癌HeLa細胞的生長和增殖;七葉皂苷鈉作用于HeLa細胞后，可見典型的凋亡細胞形態學特征，細胞凋亡率顯著增加;隨著七葉皂苷鈉濃度升高，cleaved PARP、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9明顯增多，pro-caspase-3顯著減少，p-Akt和p-ERK激活減少，細胞內DR4和DR5總蛋白水平上調。結論:七葉皂苷鈉通過抑制細胞存活相關信號通路，上調死亡受體水平，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

七葉皂苷鈉;宮頸腫瘤;細胞凋亡;死亡受體;Akt通路;ERK通路

七葉皂苷鈉(sodium aescinate，SA)是從七葉樹科植物天師栗的干燥成熟果實娑羅子中提取得到的三萜皂苷鈉鹽，臨床主要用于治療腦水腫以及創傷引起的肢體炎癥腫脹。近年來的研究顯示，七葉皂苷具有顯著的抗炎［1］、提高缺血腦組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性［2］、抑制血管新生［3-5］、抑制胰脂肪酶活性［6］等作用。已有文獻報道，七葉皂苷可以抑制人類慢性髓細胞樣白血病K562細胞［7］和急性T細胞白血病Jurkat細胞［8］的增殖，另外能夠明顯增強5-氟尿嘧啶等抗腫瘤藥物的殺傷作用［9］。但是關于七葉皂苷鈉對宮頸癌的抗腫瘤效果還未見文獻報道，它發揮抗腫瘤作用的具體分子機制和生物標靶尚未闡明。本研究以宮頸癌HeLa細胞株為研究模型，探討七葉皂苷鈉對死亡受體水平的調控作用，檢測它對細胞增殖和凋亡信號通路的影響，試圖闡明其發揮抗腫瘤作用的關鍵節點，為制定七葉皂苷鈉的臨床治療方案和拓展七葉皂苷鈉的臨床用藥范圍提供有價值的實驗和理論依據。

材料和方法

1 材料

人宮頸癌HeLa細胞株由本實驗室保存。七葉皂苷鈉購自上海阿拉丁試劑公司;DMEM完全培養液和胎牛血清購自HyClone;MTT和DAPI購自Sigma;Annexin V-FITC/PI試劑盒購自BD;聚(ADP-核糖)聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PARP］、pro-caspase-3、cleavedcaspase-8、phospho-p42/44 MAPK(Thr202/Tyr204)、phospho-Akt(Ser473)、DR4、DR5和β-actin抗體購自Cell Signaling Technology; GAPDH單克隆抗體購自Bioword;IRDye800熒光標記Ⅱ抗購自Odessey。

2 主要方法

2.1 細胞培養HeLa細胞株在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清和抗生素(1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMEM完全培養液培養，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2 MTT法檢測細胞存活率HeLa細胞提前24 h接種于96孔板，每孔細胞密度大約5×104，細胞分為空白對照組、溶劑對照組和實驗組。空白對照組細胞常規培養，不做任何處理，溶劑對照組加入DMSO，實驗組加入七葉皂苷鈉，使其終濃度分別為5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L 和100 mg/L，每組設5個重復孔，同時設置空白調零孔。各組細胞繼續培養36 h后，將培養液吸盡，加入5 g/L MTT 20 μL，培養4 h后加入150 μL DMSO溶解，酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度(A)，細胞存活率(%)=(實驗組A-空白調零孔A)/(A空白對照組×100%-空白調零孔A)×100%。

2.3 細胞形態學觀察提前24 h把對數生長期細胞接種于6孔板，密度約2×108/L。將細胞分為空白對照組、溶劑對照組和實驗組，實驗組七葉皂苷鈉為10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L。加藥24 h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照(×200)。

2.4 DAPI染色檢測細胞核形態變化細胞處理同2.3，用PBS洗3次后，避光DAPI(1 mg/L)染色3 min，再用PBS避光洗3次。染好色的細胞在熒光顯微鏡下觀測并拍照分析。

2.5 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡率分組處理細胞，0.25%胰酶消化，800 r/min離心收集細胞樣品，冷PBS洗2次，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書處理細胞樣品，即用含Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL的標記液重懸細胞后，避光室溫孵育15 min，加入1×Binding Buffer 400 μL。流式細胞儀檢測和數據分析，每次計數1×104個細胞。

2.6 免疫印跡法各組細胞處理后，用預冷的PBS漂洗2次，加入預冷的細胞裂解液在冰上孵育30 min，收集細胞裂解物，4℃、15 000×g離心15 min，收取離心上清液。用紫外分光光度法測定樣品蛋白濃度。加入上樣緩沖液煮沸5 min，按蛋白含量測定結果上等量樣品，進行SDS-PAGE(10%或12%)并轉移至NC膜上。再將膜置于5%脫脂奶粉的TBS封閉液中封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜，熒光標記Ⅱ抗室溫孵育1 h，用Odyssey紅外雙色激光成像系統掃描并計算信號條帶熒光值。

3 統計學處理

用SPSS 13.0軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 七葉皂苷鈉對HeLa細胞存活率及細胞形態學的影響

未經處理的HeLa細胞多呈鋪路石狀，細胞輪廓清晰;用10 mg/L七葉皂苷鈉處理細胞24 h后，部分細胞邊緣收縮，與鄰近細胞分離、脫壁;40 mg/L組發生明顯的凋亡現象，細胞出現空泡、破碎，見圖1。MTT結果顯示七葉皂苷鈉可以顯著降低HeLa細胞的存活率，且七葉皂苷鈉對細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，見圖2。

Figure 1.Morphology of HeLa cells after sodium aescinate(SA)treatment.圖1 七葉皂苷鈉對細胞形態學變化的影響

Figure 2.Sodium aescinate(SA)inhibited the viability of HeLa cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 七葉皂苷鈉對HeLa細胞存活率的影響

2 七葉皂苷鈉對HeLa細胞核形態的影響

空白對照組中細胞核外觀為不規則橢圓形，染色均勻，呈淺藍色。用不同濃度七葉皂苷鈉處理后，細胞核大小不均，染色加深，視野中可見新月形或大小不等的圓形小體，即核小體，見圖3。

3 七葉皂苷鈉對細胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI結果顯示，七葉皂苷鈉低濃度組就能引起HeLa細胞凋亡，中濃度組和高濃度組HeLa細胞凋亡率顯著增高，呈量-效關系，見圖4。

4 七葉皂苷鈉對細胞凋亡相關蛋白的影響

Western blotting結果顯示，空白對照組和溶劑對照組的凋亡相關蛋白沒有明顯變化，但隨著七葉皂苷鈉作用濃度的升高，PARP切割顯著增多，cleaved caspase-8和cleaved caspase-9切割帶明顯增強，procaspase-3前體顯著減少，見圖5。

Figure 3.Nuclear morphology of HeLa cells after sodium aescinate(SA)treatment.圖3 七葉皂苷鈉對HeLa細胞核形態的影響

Figure 4.Cell apoptosis induced by sodium aescinate(SA).圖4 七葉皂苷鈉對細胞凋亡率的影響

Figure 5.Effects of sodium aescinate(SA)on apoptosis-related proteins.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖5 七葉皂苷鈉對細胞凋亡相關蛋白的影響

5 七葉皂苷鈉對Akt和ERK信號通路的影響

不同濃度的七葉皂苷鈉處理HeLa細胞4 h后，明顯抑制了Akt和ERK的活化，p-Akt和p-ERK蛋白表達水平明顯減少，見圖6。

6 七葉皂苷鈉對死亡受體蛋白表達的影響

與空白對照組相比，20 mg/L和40 mg/L七葉皂苷鈉能使DR4和DR5的表達明顯上調，而10 mg/L組變化不顯著，溶劑對照組基本沒有變化，見圖7。

Figure 6.Sodium aescinate(SA)inhibited the phosphorylation of Akt and ERK.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖6 七葉皂苷鈉抑制Akt和ERK的磷酸化

Figure 7.Effects of sodium aescinate(SA)on the expression of TRAIL receptors(DR4 and DR5)in HeLa cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖7 七葉皂苷鈉對TRAIL受體(DR4和DR5)表達的影響

討論

雖然已有文獻報道，七葉皂苷鈉具有抗腫瘤作用［8-10］，但其對宮頸癌HeLa細胞的凋亡誘導作用尚未見報道。我們的實驗結果表明，七葉皂苷鈉能夠顯著降低HeLa細胞存活率。經過七葉皂苷鈉處理的HeLa細胞，具有典型的凋亡形態學變化特征，包括染色體聚集和細胞核破碎。Annexin V-FITC/PI實驗結果表明七葉皂苷鈉明顯增加HeLa細胞的凋亡率。以上結果證實，七葉皂苷鈉能夠誘導宮頸癌He-La細胞凋亡，且具有劑量依賴性。

在本研究中，我們首次證實七葉皂苷鈉通過外源性死亡受體途徑和內源性線粒體途徑誘導HeLa細胞凋亡;在細胞凋亡的早期階段，caspase-8和caspase-9顯著激活;死亡受體DR4和DR5總蛋白水平在七葉皂苷鈉作用后明顯增加。DR4和DR5又稱為TRAIL受體1和TRAIL受體2，在其胞漿端含有死亡結構域，通過募集接頭蛋白Fas相關死亡結構域蛋白，向細胞內傳遞凋亡信號［11］。因此，在HeLa細胞表面的DR4和DR5表達增加，可能促進下游caspase-8蛋白的激活。七葉皂苷鈉作用HeLa細胞后，線粒體通透性增加，激活caspase-9形成凋亡小體。Caspase-8和caspase-9的活化可進一步引起效應蛋白caspase-3的活化及其底物PARP的切割。

眾所周知，多種蛋白激酶途徑參與調節細胞增殖和細胞存活。絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogenactivated protein kinases，MAPKs)，在多種細胞模型中，參與細胞凋亡和細胞周期的調控［12］。MAPKs家族包括3個成員，分別是細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK。 JNK和p38 MAPK主要發揮誘導細胞凋亡作用，而ERK作為細胞存活調節子，在促進細胞存活和細胞分化中扮演著關鍵的角色。除了MAPKs家族，另外一個蛋白激酶Akt通過磷酸化與細胞死亡相關的多種因子，保護細胞免受凋亡傷害［12］。我們的實驗結果表明，七葉皂苷鈉能夠阻斷ERK和Akt信號途徑，在濃度為10 mg/L時ERK和Akt磷酸化水平已經顯著下調，在濃度為40 mg/L時可見ERK和Akt磷酸化信號非常弱。因此，七葉皂苷鈉促進HeLa細胞凋亡可能與抑制Akt和ERK細胞存活信號通路有關。

綜上所述，我們的研究結果證實七葉皂苷鈉能夠抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，促進細胞凋亡，其作用機制與抑制細胞存活信號途徑Akt和ERK有關。激活外源性死亡受體途徑和內源性線粒體途徑也是七葉皂苷鈉觸發細胞凋亡的重要分子機制。本研究為臨床制定宮頸癌預防和治療策略提供有價值的參考。而且七葉皂苷鈉能夠明顯提高細胞內TRAIL受體DR4和DR5水平，在對TRAIL不敏感的腫瘤的治療中，能否作為輔助藥物增加腫瘤對TRAIL的敏感性，將具有很大的研究前景，也是我們下一步研究的方向。

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Sodium aescinate induces apoptosis of HeLa cells by inhibiting Akt/ERK signaling pathways and increasing death receptor expression

QI Shi-mei，QI Zhi-lin，LING Lie-feng，Lü Jun，ZHANG Yao
(Department of Biochemistry，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China.E-mail:juliaqi@163.com)

AIM:To study the effects of sodium aescinate on the apoptosis of cervical cancer HeLa cells and its molecular mechanism.METHODS:MTT assay was used to detect the growth and proliferation of HeLa cells.The morphological alteration was observed under inverted microscope.Annexin V-FITC/PI double staining and DAPI nuclear staining were used to determine the apoptosis of HeLa cells induced by sodium aescinate.The apoptosis-related proteins PARP，cleaved caspase-8 and pro-caspase-3，and the proliferation-associated molecules Akt and ERK，as well as TRAIL receptors DR4 and DR5 were detected by Western blotting.RESULTS:Sodium aescinate inhibited the growth of HeLa cells in a concentration-dependent manner.Treatment with sodium aescinate induced the typical morphology of apoptotic cells and increased the apoptotic rate significantly.The cleaved PARP，cleaved caspase-8 and cleaved caspase-9 protein expression was observed.The expression of DR4 and DR5 was up-regulated.Meanwhile，pro-caspase-3 was decreased，and the levels of p-Akt and p-ERK were down-regulated by sodium aescinate in a dose-dependent manner.CONCLUSION:Sodium aescinate inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of HeLa cells by increasing death receptor expression and repressing proliferation-associated signaling pathways.

Sodium aescinate;Uterine cervical neoplasms;Apoptosis;Death receptors;Akt pathway;ERK pathway

Q28

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.008

1000-4718(2014)02-0239-06

2013-10-09

2013-12-13

國家自然科學基金資助項目(No.31301171);活性生物大分子研究安徽省重點實驗室項目(No.1306C083008);高等學校省級優秀青年人才基金重點項目(No.2013SQRL055ZD);皖南醫學院博士科研啟動基金資助項目

△通訊作者Tel:0553-3932462;E-mail:juliaqi@163.com