葡萄籽原花青素對順鉑所致小鼠腎毒性作用的影響

高兆麗，劉廣義，李星，胡昭，楊向東，江蓓，李憲花

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿內(nèi)科，山東濟(jì)南 250012)

葡萄籽原花青素對順鉑所致小鼠腎毒性作用的影響

高兆麗，劉廣義，李星，胡昭，楊向東，江蓓，李憲花△

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿內(nèi)科，山東濟(jì)南 250012)

目的:探討葡萄籽原花青素(GSP)對順鉑(CP)腎毒性作用的防護(hù)及可能機(jī)制。方法：雄性C57小鼠分為4組:正常對照組(N組，n=10)、CP組(腹腔注射20 mg/kg CP，n=20)、GSP組(第1天及第3天灌胃GSP 500 mg/kg，n=15)和CP+GSP組(腹腔注射CP 30 min前給予500 mg/kg GSP灌胃，第3天灌胃等量的GSP，n= 20)。給藥后第5天取血，腎組織病理HE染色，應(yīng)用蛋白印跡法和免疫組化法檢測小鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (GRP78)和磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)的蛋白表達(dá)。結(jié)果:與N組比較，CP組腎臟指數(shù)升高，血尿素氮和血清肌酐水平升高(P＜0.05)，腎病理損傷明顯，腎組織GRP78和p-ERK蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)。與CP組相比，CP+GSP組腎臟指數(shù)降低，血尿素氮和血清肌酐水平下降(P＜0.05)，腎病理損傷減輕，GRP78和p-ERK蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:GSP能明顯降低CP所致的腎毒性，其機(jī)制與GSP下調(diào)CP導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

順鉑;葡萄籽原花青素;腎毒性;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

順鉑(cisplatin，CP)是臨床化療最常用的藥物之一。它是一種廣譜抗腫瘤藥，對實(shí)體腫瘤的療效尤為明顯，其療效與劑量成正比［1］，而順鉑的腎毒性是限制其大量使用的最常見原因，亦是其最明顯的副作用［2-4］。順鉑主要導(dǎo)致腎小管受損，順鉑致腎小管細(xì)胞損傷包括多種機(jī)制:直接毒性作用，線粒體介導(dǎo)的損傷，以及氧化應(yīng)激介導(dǎo)的損傷［1］。如何預(yù)防及減輕順鉑的腎毒性一直是研究的熱點(diǎn)。盡管國內(nèi)外進(jìn)行了大量研究，目前為止，仍沒有理想的方法。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin，GSP)是從葡萄籽中提取的一種天然植物多酚物質(zhì)，國內(nèi)也有人稱之為葡多酚［5-6］，具有強(qiáng)大的抗氧化活性，有研究證明，其抗氧化活性是維生素E的50倍，維生素C的20倍。本研究通過觀察GSP對腎功能相關(guān)指標(biāo)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78)和磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signalregulated kinase，p-ERK)的影響，探討其對順鉑所致腎毒性的保護(hù)作用及可能機(jī)制，旨在為GSP應(yīng)用于順鉑腎損害防治提供依據(jù)。

材料和方法

1 動物

健康雄性C57小鼠65只，鼠齡6～8周，體重20 ～30 g，由北京維通利華公司提供。

2 主要試劑

順鉑購自Sigma，GSP(純度96%)購自天津尖峰公司。GRP78抗體購自Abcam，p-ERK和ERK抗體購自Cell Signaling Technology，β-actin抗體購自Santa Cruz Biotechnology。山羊抗鼠和山羊抗兔Ⅱ抗購自Jackson ImmunoResearch Laboratories。

3 主要方法

3.1 順鉑小鼠動物模型的建立健康雄性C57小鼠65只，喂養(yǎng)2 d后，隨機(jī)選取10只作為對照組，另55只作為模型組及治療組。正常對照組(N組，n= 10):一次性腹腔注射等容積生理鹽水(NS，10 mL/ kg);CP組(n=20):一次性腹腔注射20 mg/kg CP(溶于生理鹽水，濃度2.0 g/L);GSP組(n=15):第1天及第3天灌胃GSP 500 mg/kg(溶于生理鹽水，濃度50 g/L);CP+GSP組(n=20):腹腔注射CP 30 min前給予500 mg/kg GSP灌胃，第3天灌胃等量的GSP(溶于生理鹽水，濃度50 g/L)。給藥后第5天內(nèi)眥取血，處死動物。

3.2 標(biāo)本采集及測定5 d后各組存活小鼠分別為:N組8只，CP組15只，GSP組13只，CP+GSP組16只。處死前取血，用BT-224型半自動生化分析儀檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)。處死動物后取出雙側(cè)腎臟，去包膜后稱重并計(jì)算腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)(renal index，RI)=雙側(cè)腎臟重(g)/體重(g)×100。部分腎臟-80℃保存，常規(guī)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，部分放入4%多聚甲醛，制備石蠟切片，常規(guī)行免疫組化，病理染色，光鏡下觀察病理變化。

3.3 蛋白質(zhì)的提取采用Trizol法提蛋白，每50～100 mg組織加入1 mL Trizol，加入Trizol的樣品在15～30℃放置5 min，加入氯仿0.2 mL每1 mL Trizol，劇烈振蕩后靜置2～3 min，4℃12 000×g離心15 min。提蛋白:移出上清，加入1.5 mL異丙醇每1 mL Trizol，室溫下?lián)u床上放置10～20 min，4℃、12 000×g離心10min。倒掉液體，加入2 mL、0.3 mol鹽酸胍每1 mL Trizol，室溫下?lián)u床上放置20 min，4℃、7 500×g離心5 min，重復(fù)3次，用2 mL乙醇振蕩起蛋白沉淀，室溫下?lián)u床上放置20 min，7 500 ×g離心5 min，真空干燥沉淀5～10 min，用1%SDS吹打混勻，50℃孵育30 min，1 000×g離心10 min，去除不溶物質(zhì)，轉(zhuǎn)移上清至另一EP管，-80℃保存。

3.4 HE染色及免疫組化新鮮組織4%多聚甲醛固定(8～12 h)然后移至0.5%多聚甲醛長期放置，組織包埋后每張切4 μm厚度，常規(guī)行HE染色。在光鏡下就HE染色標(biāo)本對腎小管壞死程度進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn):每張切片×100倍鏡下取15個視野，取受損腎小管占視野的百分比，0分:正常;1分:受損腎小管＜5%;2分:受損腎小管5%～25%;3分:受損腎小管25%～75%;4分:受損腎小管＞75%，作半定量分析并計(jì)算其均值，作為腎小管壞死的評分指數(shù)。免疫組化:石蠟切片放入梯度乙醇脫蠟后水化，然后放入0.01%檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)，92～93℃左右微波熱修復(fù)10 min后室溫冷卻，加入0.1%Triton X-100浸泡15 min后加3%雙氧水避光10 min，10%山羊血清封閉在37℃放置60 min，滴加Ⅰ抗(GRP78 1∶200，p-ERK 1∶50，陰性對照加PBS)4℃過夜，PBS洗3次，滴加Ⅱ抗(山羊抗兔)，DAB顯色，蘇木素染核，二甲苯透明后中性樹膠封片。棕褐色為陽性著色。對免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每組隨機(jī)選取2個標(biāo)本，每個標(biāo)本隨機(jī)選取10個視野在光鏡下觀察，根據(jù)每個標(biāo)本的染色強(qiáng)度及染色面積進(jìn)行評分，著色的強(qiáng)度可分為0分:無顏色;1 分:淺黃色;2分:淺褐色;3分:棕色。陽性染色區(qū)被評定為0分:＜5%;1分:5%～25%;2分:25%～50%;3分:51%～75%;4分:＞75%。這2個評分加在一起作為最后評分。

3.5 蛋白免疫印跡提取的組織使用BCA法測蛋白濃度，12%的分離膠80V電壓至marker條帶分開后改為140V，至溴酚藍(lán)跑至底部時，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉(TBST稀釋)室溫封閉1 h，Ⅰ抗(GRP78 1∶250，p-ERK 1∶1 000，ERK 1∶2 000，β-actin 1∶2 000)4℃孵育過夜，PBS洗3次，加Ⅱ抗(山羊抗兔1∶10 000，山羊抗鼠1∶5 000)，ECL發(fā)光液黑暗中5 min，暗室曝光。使用ImageJ軟件(National Institutes of Health)對蛋白免疫印跡結(jié)果進(jìn)行半定量分析，對每一個確定的蛋白條帶的亮度進(jìn)行量化。以每組與N組的比值做柱狀圖。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 11.5軟件處理。多組間總體均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 腎功能相關(guān)指標(biāo)的變化

CP組RI、BUN和Cr與N組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而CP+GSP組RI、BUN和Cr與CP組相比顯著降低(P＜0.05)。GSP 組RI、BUN和Cr與N組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

Figure 1.Parameters of renal function.N:control group(n=8);C:CP group(n=15);G:GSP group(n=13);C+G:CP+GSP group(n=16).Mean±SD.*P＜0.05 vs N group;#P＜0.05 vs C group.圖1 腎功能相關(guān)指標(biāo)的變化

2 腎臟的病理變化

光鏡下HE染色顯示，與N組比較，CP組可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹，空泡樣變性，細(xì)胞核裸露，壞死脫落，大量管型形成，腎小管損傷明顯;經(jīng)GSP治療后上述改變明顯減輕。半定量分析顯示;CP組損傷評分為3.1分，腎小管受損明顯;CP+GSP組腎損傷評分為1.7分，GSP治療后上述損傷明顯減輕，差異顯著(P＜0.05)，見圖2。這表明GSP能夠減輕順鉑引起的腎損傷。

3 蛋白免疫印跡檢測腎組織GRP78和p-ERK蛋白的表達(dá)

蛋白免疫印跡顯示，與N組比較，GRP78和p-ERK蛋白的表達(dá)在CP組明顯升高，CP+GSP組與CP組相比GRP78和p-ERK蛋白的表達(dá)明顯降低，差異顯著(P＜0.05);GSP組與N組相比無明顯差異，見圖3。

4 免疫組化檢測腎組織GRP78和p-ERK蛋白的表達(dá)

與N組比較，CP組可見高表達(dá)的GRP78和p-ERK蛋白，而CP+GSP組GRP78和p-ERK蛋白表達(dá)水平明顯降低。半定量分析結(jié)果顯示，與N組比較，GRP78和p-ERK蛋白的表達(dá)在CP組明顯升高(P＜0.05);CP+GSP與CP組相比GRP78和p-ERK的蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。這表明GSP對順鉑所致的腎損傷有保護(hù)作用，GSP降低了順鉑導(dǎo)致的腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白的表達(dá)。

Figure 2.Renal pathology(HE staining，×400).N:control group(n=8);C:CP group(n=15);G:GSP group (n=13);C+G:CP+GSP group(n=16).Mean± SD.*P＜0.05 vs N group;#P＜0.05 vs C group.圖2 腎臟的病理變化

討論

CP是廣泛用于臨床的抗腫瘤藥物，其治療效果是明顯的，尤其是在治療實(shí)體器官腫瘤，其療效與劑量成正比，而CP的腎毒性限制了其大劑量使用［2］。CP引起腎毒性的發(fā)病機(jī)制與以下幾個因素有關(guān)，包括氧化應(yīng)激、DNA損傷、線粒體功能障礙等［1］。

Figure 3.Expression of GRP78(A)and p-ERK(B)in renal tissues detected by Western blotting.Mean±SD.*P＜0.05 vs N group;#P＜0.05 vs C group.圖3 蛋白印跡分析腎組織GRP78和p-ERK蛋白的表達(dá)

Figure 4.Expression of GRP78 and p-ERK proteins in renal tissues detected by immunohistochemical staining(×400).Mean±SD.*P＜0.05 vs N group;#P＜0.05 vs C group.圖4 免疫組化分析腎組織GRP78和p-ERK蛋白的表達(dá)

本研究中，CP組小鼠BUN、Cr和RI的水平與N組相比明顯升高，腎組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示腎小管有明顯的結(jié)構(gòu)性損壞，這與以往的研究報道一致［7-8］，CP主要損傷腎小管。而與CP組相比，CP+ GSP組小鼠的BUN、Cr和RI水平呈顯著下降，腎組織病理學(xué)檢查顯示CP+GSP組腎小管結(jié)構(gòu)性破壞很輕微，表明GSP能夠減輕CP導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞損傷，減少腎毒性，改善腎功能。GSP是一種從葡萄籽中提取的高效天然抗氧化劑，具有超強(qiáng)的清除自由基能力，為強(qiáng)效自由基清除劑。GSP已被廣泛用于抗衰老、腫瘤患者，其亦能夠預(yù)防一些疾病，如動脈粥樣硬化、胃潰瘍、白內(nèi)障、糖尿病等［9-12］。

近年來一些研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CP誘導(dǎo)的腎損害中起著重要的作用［7］，CP可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對影響細(xì)胞內(nèi)能量水平、氧化狀態(tài)或鈣離子濃度異常的應(yīng)激極度敏感。當(dāng)細(xì)胞受到某些打擊，如缺氧、藥物毒性等后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)氧化環(huán)境被破壞，鈣代謝失調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂，突變蛋白質(zhì)產(chǎn)生或者蛋白質(zhì)二硫鍵不能形成，引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚以及鈣平衡失調(diào)的狀態(tài)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。缺血、缺氧、高血糖、熱休克等因素可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［13］。早期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是機(jī)體自身代償?shù)倪^程，對細(xì)胞具有保護(hù)作用;如果這種失衡超過了機(jī)體自身調(diào)節(jié)的能力，最終的結(jié)局將是細(xì)胞死亡，組織器官受損。GRP78是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一個重要的分子伴侶，它已被廣泛用于作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個指標(biāo)［14］。p-ERK是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用的跨膜蛋白，即使是輕微的應(yīng)激，p-ERK都表現(xiàn)出最至關(guān)重要的保護(hù)作用［13］。在沒有應(yīng)激的情況下，p-ERK和其它2個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)力傳感器［肌醇需求酶1 (inositol-requiring enzyme 1，IRE-1)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)］與GRP78形成穩(wěn)定的復(fù)合物。而當(dāng)?shù)鞍族e誤折疊或未折疊蛋白增多時促使GRP78與其解離，刺激下游信號的激活［15］。GRP78和p-ERK是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的重要蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記。

為了探求GSP對CP引起腎小管細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制，本研究應(yīng)用蛋白印跡及免疫組化方法測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和p-ERK在各組小鼠腎組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，GRP78和p-ERK 在CP組表達(dá)明顯升高，說明CP組存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致腎小管受損，腎功能下降，與既往報道一致［7］。而經(jīng)過GSP處理后，GRP78和p-ERK表達(dá)明顯下降，腎小管受損減輕，腎功能改善，表明GSP通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而減輕CP誘導(dǎo)的腎損害。國內(nèi)外尚未見報道。

本研究結(jié)果證實(shí)，GSP作為一種天然強(qiáng)效抗氧化劑，對CP導(dǎo)致的腎損害有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)了CP引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。對于GSP在CP導(dǎo)致腎損害中更深層的作用機(jī)制，我們將在今后的工作中進(jìn)一步深入研究。

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Effect of grape seed proanthocyanidin on cisplatin-induced nephrotoxicity in mice

GAO Zhao-li，LIU Guang-yi，LI Xing，HU Zhao，YANG Xiang-dong，JIANG Bei，LI Xian-hua
(Department of Nephrology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China.E-mail:lixianhua@medmail.com.cn)

AIM:To study the protective effect of grape seed proanthocyanidin(GSP)on nephrotoxicity induced by cisplatin(CP)in mice.METHODS:Male C57 mice were randomly divided into 4 groups:control group(N group，n=10)，CP group(intraperitoneal injection of CP at dose of 20 mg/kg，n=20)，GSP group(intragastric administration of GSP at dose of 500 mg/kg，n=15)and CP+GSP group(intragastric administration of GSP 30 min prior to intraperitoneal injection of CP and intragastric administration of the same dose of GSP 72 h later，n=20).On the 5th day after CP treatment，blood and kidney samples were collected.The renal pathological changes were examined by HE staining.The protein expression of glucose-regulated protein 78(GRP78)and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK)was examined by Western blotting and immunohistochemical staining.RESULTS:Renal index，blood urea nitrogen and serum creatinine were significantly higher in CP group than those in N group.The renal tissues were heavily damaged in CP group.The protein expression of GRP78 and p-ERK increased in CP group compared with N group.GSP treatment alleviated the increase in the renal index，blood urea nitrogen and serum creatinine.The damages of the renal tissues were attenuated.The protein expression of GRP78 and p-ERK was obviously reduced in CP+GSP group compared with CP group.CONCLUSION:GSP prevents kidney from CP-induced damage by suppression of endoplasmic reticulum stress.

Cisplatin;Grape seed proanthocyanidin;Nephrotoxicity;Endoplasmic reticulum stress

R595.4;R692.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.021

1000-4718(2014)02-0313-05

2013-09-17

2013-12-10

△通訊作者Tel:0531-82169315;E-mail:lixianhua@medmail.com.cn