響應面法優化混菌發酵豆粕的條件研究

黃達明，張 雪，管國強，宋慶春，李 倩

(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013)

發酵豆粕是指利用有益微生物發酵豆粕，同時產生微生物蛋白質，豐富并平衡豆粕中的蛋白質營養水平，最終改善豆粕的營養品質，提高飼料品質［1］。發酵豆粕已成為豆粕開發生產的熱點。朱平軍［2］等對黑曲霉發酵豆粕酸溶蛋白含量的影響條件進行了優化，優化后酸溶性蛋白含量為13.62%。Teng Da［3］等對米曲霉和枯草芽孢桿菌對豆粕的生物改性進行了研究。

多菌種聯合發酵豆粕是利用微生物之間互補的關系，把幾種微生物有機結合在一起，能產生優于單菌發酵的效果［4］。響應面法是數學方法和統計方法結合的工程優化方法，主要用于對生物產量受多個因素影響的問題進行建模和分析，其最終目的是優化該響應值，從而快速有效地確定最佳條件。近年來，響應面法在化工、生物、食品等領域也都得到了廣泛應用［5］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆粕，馬鈴薯 均為市購;米曲霉，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母 保存于本實驗室;硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、三氯乙酸、氫氧化鈉 均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

YC－L型冷凍恒溫振蕩器 鎮江格瑞生物工程有限公司;FA1004系列電子天平 上海上平儀器有限公司;YM50Z壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;80－2型離心沉淀機 江蘇金壇市中大儀器廠;UDK149型全自動凱氏定氮儀 意大利VELP公司;SHP－100型智能生化培養箱 上海三法科學儀器有限公司;DHG－9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海三法科學儀器有限公司。

1.2 培養基

米曲霉保存采用PDA培養基。

枯草芽孢桿菌保存及液體種子培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基。

釀酒酵母保存及液體種子培養基采用YPD培養基。

基礎發酵培養基:取豆粕20g，按料水比2∶1加入一定量的水，121℃滅菌30min，取出后晃動使其不貼壁。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的制備 將米曲霉接入斜面，28℃培養72h，斜面長滿孢子后加入無菌水將孢子洗下，制成孢子懸液(109個/mL)。從枯草芽孢桿菌和釀酒酵母斜面分別挑取兩環菌種到液體培養基，搖床培養24h達到生長對數期，做種子液備用［6］。

其工作原理是：通過旋轉盤根壓蓋來擠壓銅壓套，銅壓套壓緊盤根，盤根在密封函內彈簧的作用下被縱向擠壓發生橫向膨脹，從而密封柱塞與密封函的環形空間，防止高壓水刺漏及空氣進入工作腔。

1.3.2 對峙試驗 在PDA培養基上進行對峙培養，觀察米曲霉，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母在相同培養條件下是否能較好的共存，以便應用于發酵豆粕［7］。

1.3.3 酸溶性蛋白含量的測定 根據GB/T22492－2008大豆肽粉中的方法提取發酵豆粕中的酸溶性蛋白［8］:準確稱取樣品1g于100mL燒杯中，加入15%三氯乙酸溶液50mL，混合均勻，靜置5min;以中速定性濾紙過濾，棄去少許初始濾液，將濾液轉移至離心管，4000r/min下離心10min。取離心后的上清液用凱氏定氮儀測定酸溶性蛋白的含量。

1.3.4 單因素試驗 發酵培養基初始含水量為50%，接種量為10%，接種比例1∶1∶1，培養溫度為28℃，以酸溶性蛋白含量為指標，分別研究接種順序(同時接種，24h接入或者48h接入具體見表2)、枯草芽孢桿菌∶釀酒酵母∶米曲霉接種比例(2∶2∶1，2∶1∶1，1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，1∶2∶2)、接種量(8%，10%，12% ，14%，16%)、含水量(40%，50%，60%，70%，80%)、發酵溫度(26，28，30，32，34℃)和發酵時間(48，60，72，84，96h)六個因素對豆粕發酵的影響效果。

1.3.5 響應面設計 根據單因素試驗所篩選的最佳接種量，含水量和發酵溫度，應用三因素三水平的Box－Behnken 設計［9］，以酸溶性蛋白含量為響應值，采用響應面法進行分析，試驗因素及水平見表1。響應面試驗結果運用Design Expert7.0.0分析軟件進行方差分析。為了驗證所得結果的可靠性，結合實際試驗條件，在優化條件下進行驗證試驗，經過3次平行試驗，取平均值。

表1 Box－Behnken試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Box－Behnken experiments

2 結果與分析

2.1 對峙試驗

微生物本身代謝會產生不同種類的細菌素，在不同微生物或同一微生物的不同菌株之間可能產生相互拮抗相互兼容或相互促進生長的作用［7］。這些物質構成復雜，作用機理尚不清楚，但通過混合培養試驗能清晰地顯示不同菌株之間的作用。本試驗通過米曲霉，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的對峙生長試驗，結果顯示枯草芽孢桿菌，米曲霉和釀酒酵母能共同生長，相互之間不存在拮抗性。

圖1 菌株的對峙試驗Fig.1 Confrontation test of strains

2.2 單因素試驗

2.2.1 接種順序的確定 由表2可以看出，不同的接種順序對酸溶性蛋白的含量有很大的影響。試驗1是三株菌同時接種，酸溶性蛋白的含量只有10.03%;若先接種枯草芽孢桿菌24h后再接種釀酒酵母和米曲霉，酸溶性蛋白含量最高可達19%。因此最佳接種順序為先接種枯草芽孢桿菌，24h后接種釀酒酵母和米曲霉。

表2 不同接種順序對酸溶性蛋白含量的影響Table 2 Influence of different inoculation order on the acid soluble protein content

2.2.2 發酵時間的確定 發酵時間的長短直接影響發酵豆粕的品質［10］。發酵時間對發酵豆粕酸溶性蛋白含量的影響如圖2所示。隨著發酵時間的延長，發酵豆粕中酸溶性蛋白的含量不斷增加，在72h時達到最高，之后出現下降平穩趨勢?？紤]到工業化生產易染菌，嚴格控制發酵周期，保證發酵豆粕品質，選擇72h為最佳。

圖2 發酵時間對酸溶性蛋白的影響Fig.2 Influence of fermentation time on the acid soluble protein

2.2.3 接種比例和接種量的確定 不同的接種比例和接種量交互影響發酵豆粕中酸溶性蛋白的含量，選取枯草芽孢桿菌∶釀酒酵母∶米曲霉接種比例(2∶2∶1，2∶1∶1，1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，1∶2∶2)分 別 對 應 試驗編號1～6，由圖3中的a圖可以看出，當接種比例為1∶1∶2時，發酵豆粕的酸溶性蛋白含量最高為18.34%。米曲霉含量低的接種比例對應酸溶性蛋白含量稍低，因此選擇最佳接種比例為1∶1∶2。

圖3中的b圖顯示當接種量為8%時，酸溶性蛋白含量較低，隨著接種量的增加酸溶性蛋白的含量先增加后降低。在接種量為10%時，酸溶性蛋白的含量達到最高18.09%，因此，選擇10%為最佳接種量。

圖3 不同接種比例及接種量對酸溶蛋白含量的影響Fig.3 Influence of different proportion and inoculated quantity on the acid soluble protein content

2.2.4 發酵溫度的確定 由圖4看出，豆粕發酵過程中酸溶性蛋白的含量有先增加后減少，最后達到平緩的趨勢。由于枯草芽孢桿菌的最適溫度是37℃，而釀酒酵母和米曲霉的最適溫度在28℃左右，不在同一范圍，混菌發酵溫度不一定是某一種菌的最適生長溫度，因此由圖4知，混菌發酵的最佳溫度在30℃左右。

圖4 發酵溫度對酸溶性蛋白含量的影響Fig.4 Influence of fermentation temperature on the acid soluble protein content

2.2.5 含水量的確定 對于固態發酵來說，培養菌基質中的水分含量是影響菌體酸溶蛋白增加的一個重要因素［11］。本試驗發現含水量從40%到80%過程中，發酵豆粕中酸溶性蛋白的含量先增加，后平穩，之后下降又有上升趨勢。如圖5，當含水量為60%時，酸溶性蛋白的含量最高。

圖5 含水量對酸溶性蛋白含量的影響Fig.5 Influence of water content on the acid soluble protein content

2.3 響應面分析

2.3.1 響應面設計及結果 綜合分析單因素試驗，確定接種順序、發酵時間和接種比例3個因素，選擇對酸溶性蛋白含量影響顯著的接種量、含水量和發酵溫度3個因素為自變量，根據Box－Behnken的設計原理，以酸溶性蛋白含量為響應值設計試驗。響應面試驗設計及結果見表3。

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析 使用Design Expert7.0.0分析軟件，對試驗數據進行擬合，得到二次多項回歸方程:

由表4回歸模型方差分析可知，二次回歸模型極顯著，失擬項不顯著，說明建模成功。響應面的回歸系數R2=0.9574，校正后的 Adj R2=0.9027，Adeq Precision測得的信噪比=11.689通常大于4，這表明該模型的擬合程度較好，實驗誤差較小，能夠用于發酵豆粕條件的分析和預測［12］。方差分析結果還表明，B和C對酸溶性蛋白含量的影響顯著，A2和B2對酸溶性蛋白含量的影響極顯著，說明B含水量是影響豆粕發酵過程的重要因素，而AC的交互作用影響極顯著。從方差分析表中的F值可知，各因素對發酵豆粕酸溶性蛋白含量的影響程度大小為:含水量＞發酵溫度＞接種量。

表3 Box－Behnken設計及結果Table 3 Design and results of Box－Behnken

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis results of regression and variance

2.3.3 響應面分析 從圖6可以看出，在所選的范圍內存在極值點。響應值酸溶性蛋白的含量隨著接種量、含水量、溫度呈現先增大后下降的趨勢，且三個響應曲面都呈開口向下的凸形曲面。根據響應面法建立的數學模型分析，預測出最佳發酵條件為:接種量10.17%、含水量60.23%、溫度32℃，響應面模型在此條件下預測到的酸溶性蛋白含量為21.07%。

2.3.4 驗證試驗 考慮到試驗的實際情況和操作可行性，對最佳發酵條件進行調整，最佳發酵條件選取接種量10%、含水量60%、發酵溫度32℃，3次平行試驗的結果表明，發酵豆粕酸溶性蛋白的含量為20.73%，與預測值相近，說明模型準確性較高，能較好地預測豆粕的發酵條件。

圖6 接種量和含水量、接種量和溫度、含水量和溫度對酸溶性蛋白含量影響的響應面圖Fig.6 Response surface of inoculation quantity and water content，inoculation quantity and temperature，water content and temperature on the influence of acid soluble protein content

3 結論

對峙試驗表明米曲霉、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母相互兼容，能用于混菌發酵豆粕。單因素試驗研究了接種順序、接種比例、接種量、含水量、發酵時間和發酵溫度對酸溶性蛋白含量影響的趨勢，在此基礎上運用響應面分析得出最佳發酵工藝條件:接種量10%、含水量60%、發酵溫度32℃、發酵時間72h、接種比例為1∶1∶2和接種順序為先接枯草芽孢桿菌24h后接種釀酒酵母和米曲霉。在最佳條件下，發酵豆粕酸溶性蛋白的含量為20.73%。

研究表明，枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和米曲霉混菌發酵豆粕，能很好的降解大分子蛋白，提高酸溶性蛋白的含量，提高豆粕的利用率。

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