反相高效液相色譜法測定泡蘿卜中的有機酸

王 冉，李小林，李 敏，魏 靜，陳安均，敖曉琳，蒲 彪，*

(1.四川農業大學食品學院，四川雅安625014;2.四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川成都610066)

泡菜是我國傳統特色發酵食品的典型代表之一［1］。傳統四川泡蘿卜借助于老鹽水中的微生物以及天然附著在蔬菜表面上的微生物進行發酵作用，在發酵過程中，由于乳酸菌、醋酸菌等微生物的活動，會產生大量的乳酸、乙酸等有機酸，這些有機酸賦予了四川泡蘿卜適宜的酸味，同時這些有機酸可以與醇類等其它物質相互作用產生酯類等香味物質，增加泡蘿卜的風味［2］。近年來，高效液相色譜法已被廣泛應用于有機酸的分析中［3－5］，但在泡蘿卜中的研究鮮有報道。本文試圖建立反相高效液相色譜法分析泡蘿卜中草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等8種有機酸的含量，以期對研究蘿卜泡制過程中有機酸等風味物質的形成與微生物之間的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮蘿卜 購于雅安菜市場;老泡菜水 收集于學校周邊飯店。

琥珀酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸 購于美國化學試劑公司;乙酸、乳酸、抗壞血酸 購于美國sigma公司;磷酸、磷酸二氫鉀均為分析純 成都市科龍化工試劑廠;甲醇為色譜純 廣東光華科技股份有限公司。

島津LC－20101C高效液相色譜儀 LC solution工作站，UV－VIS檢測器，日本島津公司;YMC－Pack ODS－AQ C18色譜柱(5μm，120A，4.6mm ×150mm)YMC公司;精密PHS－4C+型酸度計 成都世紀方舟科技有限公司;超純水制備儀 四川優普超純科技有限公司;KQ5200DB型數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;CP225D型電子天平 德國賽多利斯股份公司。

1.2 方法

1.2.1 泡蘿卜的制備 傳統發酵泡蘿卜:以紅皮蘿卜為原料，將新鮮的紅皮蘿卜洗凈、晾干，以料液比1∶1用老鹽水泡制，并補鹽至泡菜水鹽濃度為7%，于常溫條件下泡制。

1.2.2 有機酸標準溶液的配制 有機酸的單標溶液:分別稱取乳酸4.35mg、蘋果酸3.68mg、檸檬酸4.35mg、酒 石 酸 3.40mg、抗 壞 血 酸 2.62mg、草 酸1.10mg、琥珀酸 8.01mg、乙酸 2.35μL，分別用超純水溶解并定容至10mL，于4℃冰箱保存，使用前經0.45μm 濾膜過濾［6］。

有機酸混合標準溶液:稱取適量各有機酸標準品，配制成5mg/mL乳酸、1mg/mL的酒石酸和抗壞血酸，其余酸質量濃度為2mg/mL的混合標準溶液，作為母液，于4℃冰箱保存。在使用時，將其依次稀釋為母液濃度的 1、0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032倍，經 0.45μm 濾膜過濾后使用［6］。

1.2.3 色譜條件 YMC－Pack ODS－AQ C18色譜柱(5μm，120A，4.6mm ×150mm);流動相為 4% 甲醇－96%的0.05mol/L KH2PO4溶液(用 H3PO4調節pH2.9);流速0.6mL/min;柱溫27℃;進樣量10μL;檢測波長210nm。

1.2.4 樣品預處理 準確稱取已切碎混勻的樣品2.5000g，用超純水定容至50mL，過濾后取濾液離心(10000r/min，10min)，上清液經 0.45μm 濾膜過濾后直接進樣。

1.2.5 數據處理 在LC solution工作站中，根據色譜圖中各峰的保留時間和內標法進行定性分析;根據峰面積和標準曲線，對樣品中有機酸進行定量分析，利用SPSS19.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗初步確定有機酸分離色譜分離條件

2.1.1 檢測波長的確定 結果表明抗壞血酸和乙酸的最大吸收分別為242nm和233nm，其余6種有機酸在210nm處的吸收與204nm處的最大吸收相差不大，綜合考慮抗壞血酸和乙酸的最大吸收波長，以下實驗均采用210nm波長進行檢測。

2.1.2 色譜柱的選擇 對于有機酸的分離，目前國內使用鍵合十八烷基填料(C18)色譜柱的較多［3－8］，實驗中考慮使用 Kromasil 100－5C18色譜柱和 YMCPack ODS－AQ C18色譜柱。由于泡蘿卜中的有機酸為水溶性物質，因此在分離有機酸時使用的流動相應為高比例的水相溶劑。而Kromasil 100－5C18色譜柱以硅膠為基質，硅膠在水中的溶解度較流動相中高，若長時間用純水相或高比例水相沖洗柱子，很容易造成固定相流失，使柱效下降。而YMC－Pack ODS－AQ C18色譜柱是親水性色譜柱，在高含水量甚至純水中對有機酸等強極性物質具有較強的保留能力。因此，選擇YMC－Pack ODS－AQ C18色譜柱進行本實驗。

2.1.3 流動相種類的選擇 甲醇－水系統和磷酸鹽緩沖液系統是C18柱中應用最廣泛的流動相，其中磷酸鹽緩沖液系統較適宜于有機酸的測定［9］。在流速1mL/min，柱溫25℃，進樣量 10μL，檢測波長 210nm的初始色譜條件下，分別用0.05mol/L的 KH2PO4、NaH2PO4、NaHPO4溶液(H3PO4調節 pH2.5)作為流動相對配制的有機酸混合標準溶液進行分離，結果見圖1，三種磷酸鹽作為流動相時有機酸的分離效果差別不大，均可以作為流動相。本實驗中選擇KH2PO4作為流動相。

2.1.4 流動相濃度的選擇 磷酸鹽緩沖液濃度的高低影響酸存在形式的穩定性，從而影響分離效果［3］。將流動相配制成不同濃度的溶液，其余按照2.1.3的較優色譜條件，研究流動相濃度對各酸保留時間的影響(見圖2)。由圖2可知，流動相濃度對琥珀酸與蘋果酸2以及蘋果酸2與檸檬酸的分離效果影響較大，當流動相濃度為0.05mol/L時，它們能較好分離，隨著流動相濃度的繼續增加，其分離效果稍有增強。但由于高濃度的鹽會對泵和柱子的壽命產生影響，因此選擇0.05mol/L的KH2PO4溶液進行后續單因素實驗。

圖2 流動相濃度對保留時間的影響Fig.2 Effect of mobile phase’s concentrations on retention time

2.1.5 流動相pH的選擇 有機酸為弱酸，在水溶液中會解離，可通過調節流動相的pH以達到抑制解離的作用。將流動相調成不同pH，其余按照2.1.4的較優色譜條件，得到流動相pH對有機酸分離的影響，由圖3可知流動相pH對有機酸的分離影響很大，其中對檸檬酸、蘋果酸2的保留時間影響最大。另外，當 pH 為2.1、2.3、2.5、2.7、3.1 時，乳酸和抗壞血酸完全不能分開，僅pH為2.9時，乳酸和抗壞血酸可以分開，各酸均能較好地分離，因此選擇pH2.9進行后續單因素實驗。

圖3 流動相pH對保留時間的影響Fig.3 Effects of different pH values on retention time

2.1.6 甲醇添加量的選擇 在流動相中加入甲醇可以有效的改善峰形，且對各有機酸的出峰時間也有較大影響［4］。在流動相中分別添加不同體積的甲醇，在2.1.5的較優色譜條件下，考察甲醇添加量對有機酸分離效果的影響。由圖4可知，甲醇添加量為0%時，各峰的拖尾嚴重，峰形不好，分析時間較長。加入甲醇后，乳酸和抗壞血酸的出峰順序發生變化，且隨著甲醇含量的增加，有機酸的疏水基與固定相的相互作用減弱，保留時間下降，檸檬酸和乙酸的分離度降低;抗壞血酸和蘋果酸1的分離度也逐漸較小，但乳酸和抗壞血酸的分離度增加。當甲醇添加量為1%時，乳酸和抗壞血酸分離度很小;當甲醇添加量為3%時，乳酸和抗壞血酸的分離度較小，但檸檬酸和乙酸的分離度較大;當甲醇添加量為5%時，各酸均能較好分離;當甲醇添加量為7%和9%時，檸檬酸和乙酸已經完全不能分開。因此，選擇5%進行后續單因素實驗，選擇3%～5%進行正交實驗。

圖4 甲醇添加量對各有機酸保留時間的影響Fig.4 Effects of methanol content on retention time

2.1.7 流速的選擇 在2.1.6的較優色譜條件下，調整流動相的流速，可知(圖5)流速太高，各酸的保留時間下降，分離度降低，且柱壓隨著流速的升高而升高，當柱壓太高時，對柱子的保護和長期使用不利。但當流速太低時，各酸的保留時間明顯增加，分析時間大大延長，當流速降低到0.2mL/min時，25min尚未完成對8種有機酸的檢測。綜合分析，選擇0.6mL/min進行后續單因素實驗，選擇0.6～0.8mL/min進行正交實驗。

2.1.8 柱溫的選擇 在2.1.7較優色譜條件下，改變柱溫，考察柱溫對有機酸分離效果的影響，如圖6所示，柱溫對抗壞血酸、檸檬酸、蘋果酸2和琥珀酸的保留時間影響較大，且隨柱溫的升高均逐漸減小。隨著柱溫的逐漸升高，乙酸和檸檬酸的分離度逐漸降低，當柱溫達到30℃時，乙酸和檸檬酸在同一時間出峰，完全不能分離，繼續升高柱溫至35℃時，乙酸和檸檬酸改變出峰順序;而乳酸和抗壞血酸的分離度則隨著柱溫的升高而增大。結果表明，當溫度達到25℃時，各酸在10min以內可以達到有效的分離。

圖5 流速對各有機酸保留時間的影響Fig.5 Effects of flow rate on retention time

圖6 柱溫對各有機酸保留時間的影響Fig.6 Effects of column temperature on retention time

2.2 正交實驗優化有機酸分離色譜分離條件

在單因素實驗結果的基礎上，采用正交實驗表L9(34)，以流動相pH、甲醇添加量、流速和柱溫四個因素進行正交實驗，采用串行色譜響應函數HCRF［7］作為優化指標，確定各因素主次，并確定最優組合。正交實驗因素水平表和正交實驗表見表1和表2。

式中:n是色譜峰的數目，Rs min是最難分離物質對的分離度，T是最后流出色譜峰的保留時間。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels table of orthogonal test

對正交實驗的結果進行極差分析，結果見表2。由極差分析可知，R越大，表明該因素對指標的影響越大，因此各因素對有機酸分離效果的的主次順序為:流動相pH＞柱溫＞甲醇添加量＞流速。最終選擇的最優分離條件為:4%甲醇－96%的0.05mol/L KH2PO4(用 H3PO4調節 pH2.9);流速0.6mL/min;柱溫27℃;進樣量10μL;檢測波長210 nm。

圖7和圖8分別是該色譜條件下測定有機酸混合標液與泡蘿卜中有機酸的色譜圖，從色譜圖可以看出，泡蘿卜中的8種有機酸均能得到有效分離，可根據各酸的保留時間對樣品中的有機酸進行初步定性分析。

表2 正交實驗表和極差分析Table 2 The orthogonal test table and range analysis

圖7 有機酸混合標準樣品色譜分離圖Fig.7 Chromatogram of standard organic acids

圖8 泡蘿卜樣品中有機酸的色譜分離圖Fig.8 Chromatogram of organic acids in pickled radish

2.3 標準曲線的制作

在上述得到的最優條件下，將有機酸混合標樣母液稀釋成6個濃度梯度的有機酸溶液，分別以10μL進樣，以峰面積 y對質量濃度(x，mg/mL)作圖，制作標準曲線(表3)，對結果進行回歸分析，由表3可知，各有機酸的相關系數在0.99～1.0范圍內，線性關系良好。再以3倍信噪比(S/N)時各有機酸的濃度作為最小檢測限(表3)。

2.4 樣品預處理方法的優化

分別用超純水和流動相提取樣品中的有機酸，根據提取有機酸總量的多少選擇較優的提取方式。結果表明，流動相和超純水兩種不同提取方式所提取得到的8種有機酸的總量分別為12.97mg/100g和13.43mg/100g。雖然兩種提取方式的提取結果相差不大，但由于超純水提取方式更方便，且經濟成本較低，因此本實驗選擇用超純水提取作為樣品的前處理方式。

2.5 精密度和回收率的測定

取同一樣品5份，分別采用超純水提取有機酸，經0.45μm濾膜過濾后上樣，用于考察方法的精密度，如表3所示，8種有機酸的RSD在0.34%～2.18%之間。另取同一樣品4份，1份作為本底，另外3份樣品分別按測試樣品有機酸總量的 80%、100%、120%加入有機酸混合標樣，得到各有機酸的回收率，如表3所示，均在90.59%～103.85%之間。表明該方法準確靈敏、重現性好、回收率高。

2.6 泡蘿卜樣品中有機酸的分析

新鮮蘿卜和泡菜樣品按上述得到的最佳樣品預處理方法處理后，按最佳色譜條件進行測定，結果見表4，在新鮮蘿卜和泡蘿卜中均檢測出除酒石酸之外的7種有機酸。草酸是一種廣泛存在于植物中的有機酸，草酸含量過多，產品口感發澀，影響品質［10］。蘋果酸和抗壞血酸均有爽快的酸味，但蘋果酸略有苦味［11］。乳酸的酸味柔和，有后酸味，可提供柔和的風味［12］。醋酸有較強的刺激味，適量的醋酸，酸味柔和，有強化食欲的功能。檸檬酸爽快可口，能賦予泡蘿卜較好的酸味。琥珀酸的呈味特點是酸和鮮，且琥珀酸的鈉鹽閾值較低，可以賦予產品鮮美的味道［13］。由表4知，使產品具有澀味和苦味的草酸與蘋果酸的含量在蘿卜泡制后減少，而賦予泡蘿卜爽快酸味和鮮味的乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的含量則升高，其中乳酸是泡蘿卜中含量最高的有機酸。

表3 回歸分析、精密度和回收率、檢測限Table 3 Regression analysis，precision and recovery，detection limit

表4 蘿卜泡制前后有機酸的變化(mg/100g)Table 4 Contents of organic acid in pickled radish(mg/100g)

3 結論

3.1 在實驗中建立了反相高效液相色譜法同時分析泡蘿卜中8種有機酸的方法:YMC－Pack ODS－AQ C18 色譜柱(5μm，120A，4.6mm ×150mm)，4%甲醇－96%的0.05mol/L KH2PO4(H3PO4調節pH2.9)作為流動相，流速0.6mL/min，柱溫27℃，進樣量10μL，檢測波長210nm。在此條件下，8種有機酸能夠獲得較好的分離，回收率為 90.59%～103.85%，RSD為0.34%～2.18%。該方法具有靈敏度高、測試組分多、速度快等優點，適用于泡蘿卜中有機酸的測定。

3.2 實驗比較了超純水和流動相提取泡蘿卜中有機酸的效果，表明超純水提取效果好于流動相提取。與孫基梁［14］在采用蒸餾水提取、流動相提取以及甲醇提取法提取銀杏果和枸杞中有機酸時的結果一致。另外，賈洪鋒等［3］用加熱提取和超聲波提取方式提取發酵辣椒中有機酸，結果表明加熱提取的效果好于超聲波提取，然而本實驗中檢測的酸中含有抗壞血酸，加熱可能會造成抗壞血酸的分解，因此實驗中不予加熱。

3.3 實驗對泡蘿卜中的8種有機酸進行了定量分析。其中，乳酸是含量最多的有機酸，其他酸雖然含量相對較少，但是在泡蘿卜的風味形成中同樣具有重要的作用。而酒石酸在新鮮蘿卜和泡蘿卜中均未檢測到，可能是由于酒石酸含量太少或是草酸影響了酒石酸的檢測，還需進一步研究。

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