PPAR-α激動劑對PAN誘導腎小球足細胞損傷的保護作用

許俊銘，潘方瑜，劉 源，岳曉陽，鄒 軍

（1.廈門大學基礎醫學系，福建 廈門 361102；2.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶 404100）

局灶性腎小球硬化（FSGS）是多種腎臟疾病發展的最終結局，同時也是腎單位退行性病變的必經之路。足細胞是一種高度分化的細胞，足細胞分裂增殖能力有限，一旦損傷丟失就很難再生，其病變所致的足細胞肥大、足突融合、腎小球基膜（GBM）裸露等一系列變化將最終導致腎小球硬化的發生［1］。

PPAR-α是一種核受體轉錄因子，高表達于脂肪酸代謝旺盛的組織中，如脂肪組織、肝臟、心臟以及腎臟皮質，PPAR-α在機體內作用廣泛，除調節脂代謝外，還具有抗炎、抗纖維化作用。研究表明［1］，PPAR-α在代謝紊亂綜合征的病理過程及其相關腎臟并發癥中具有關鍵作用。PPAR-α激動劑能夠明顯改善2型糖尿病小鼠尿蛋白水平和腎小球纖維化程度［1-3］。另外一些研究表明［1，4］，PPAR-α缺失的小鼠經DOX處理后出現更嚴重的尿蛋白以及腎小球足細胞缺失。盡管在許多腎臟疾病中，PPAR-α都表現出保護作用，但是其在氨基核苷嘌呤霉素（PAN）誘導的大鼠腎小球足細胞損傷中的作用報道較少。因此，我們擬通過建立PAN大鼠腎小球足細胞損傷模型，以尿蛋白水平的上升和足細胞損傷標志物desmin的表達上調作為成模型標準，通過PPAR-α特異性激動劑非諾貝特予以治療，探索PPAR-α激動劑非諾貝特對足細胞損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ♀ SPF級8周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，體質量190～210 g（購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司）。

1.2 試劑與儀器 PAN（ENZO Life Science corporation，USA）；非諾貝特（Sigma，USA）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（BIO-RAD，USA）；ECL（Millipore，USA）；TRIzol（Invitrogen corporation，USA）；逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher，USA）；SYBR實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa，Japan）；Desmin rabbit antibody（Dako Cytomation，USA）；GAPDH rabbitantibody（Abcam，USA）；HRP標記羊抗兔二抗（北京聯科生物公司，北京）；冷凍離心機（Eppendorf，USA）；PCR儀（Thermo Fisher，USA）；實時熒光定量 PCR儀（ABI，USA）；酶標儀（Molecular Device，USA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及分組 SD大鼠18只，隨機分為3組：空白對照組（CON組）、PAN模型組（PAN組）、非諾貝特治療組（FEN組）。PAN組和FEN組以65 mg·kg-1體重一次尾靜脈注射PAN（溶解于生理鹽水），CON組一次尾靜脈注射等體積生理鹽水。尾靜脈注射PAN制作模型1 d后，FEN組每日每只以40 mg·kg-1體重非諾貝特灌胃，CON組和PAN每日給予等量的飲用水。分別于造模前1 d（d 0），造模后 d 6（d 6），造模后 d 10（d 10），收集 24 h尿樣測定尿蛋白濃度，計算24 h尿蛋白量。d 10對大鼠進行安樂死，取出腎臟，收集腎皮質并剪成小塊，置于60目滅菌篩網上進行研磨，同時以PBS進行沖洗，富含腎小球的部分將掉落于下層的100目篩網上，再以PBS進行沖洗，置于最底層的160目篩網將收集最終的腎小球樣本。

1.3.2 Western blot 加入適量裂解液（8 mol·L-1urea，1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1Tris-HCL，pH＝8.0）于腎小球樣本內，提取總蛋白，利用Bradford法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白轉印到PVDF膜上，5%封閉液室溫封閉1 h，一抗孵育4℃過夜，二抗室溫孵育40 min，孵育ECL，顯影曝光。

1.3.3 mRNA檢測 利用TRIzol試劑盒提取腎小球總RNA（按說明書操作）。取RNA 2μg，加primer-oligo（dT）181μl，補加 DEPC處理水至 12μl，65℃預變性5min。取出后促冷，分別加入5×Reaction buffer 4μl；Ribo lock 1μl；10 mmol·L-1dNTP 2μl；Revert Aid 1μl，按如下條件進行逆轉錄反應：42.0℃ 60 min；70.0℃ 5 min；95.0℃ 5 min；4.0℃保存。

取逆轉錄產物cDNA進行Real Time PCR，反應體系：cDNA 1μl；SYBR Taq酶混合物10μl；ROX 0.4μl；Primer F 0.5μl；Primer R 0.5μl，滅菌水補足至20μl。按如下反應體系進行Real Time PCR，循環數為 40，95.0℃ 1 min（預變性階段）；95.0℃15 s（變性階段）；60.0℃ 31 s（退火階段）。收集結果，雙ΔCt法分析結果。相關引物序列：bax F：5′-AGACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′；bax R：5′-TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′；Caspase-3 F：5′-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3′； caspase-3 R：5′-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3′；p38F：5′-CCGAG CGATACCAGAAC-3′；p38 R：5′-CACATC CAACAGACCAATC-3′；GAPDH F：5′-ACCACAGTC CATGCCATCAC-3′；GAPDH R：5′-TCCACCACCCT GTTGCTGTA-3′；desmin F：5′-TCTTTATTGTTTCT GTCCAGGG-3′；desmin R：5′-GCTGTAAGAGAGAA CTGGAAGG-3′；Vimentin F：5′-CGTTTCCAAGCCT GACCTCACG-3′；Vimentin F：5′-GCCATCTTTACAT TGAGCAGGT-3′；TGF-βF：5′-CATTGCTGTCCCGT GCAGA-3′；TGF-βR：5′-AGGTAACGCCAGGAATT GTTGCTA-3′；Smad-7 F：5′-TGCTGTGCAAAGTGTT CAGGTG-3′； Smad-7 R：5′-CCATCGGGTATCTGG AGTAAGGA-3′；ZO-1 F：5′-GCACTGCAACGCTGCC TTTA-3′；ZO-1 R；5′-TTCTCGTGTCTCTGGAGCAG GTA-3′；α-actinin F：5′-GCGAGTGCACAAGATCTC CAAC-3′；α-actinin R：5′-CATGCCCAGGGTCATCTT CA-3′；podocin F：5′-AATTCCTTGTGCAAACCACT ATGA-3′；podocin R：5′-CCAAGGCAACCTTTGCA TCT-3′。

1.4 數據統計分析 采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析。計量資料采用s表示，計數資料采用百分比表示，計量資料之間差距，采用方差分析進行比較，計數資料間的差距采用卡方檢驗進行比較。

2 結果

2．1 非諾貝特降低PAN誘導的大鼠24 h尿蛋白水平 注射PAN造模后，PAN組24 h尿蛋白水平在d10明顯上升，FEN組給予非諾貝特治療之后24 h尿蛋白水平較PAN組下降了45%（Fig 1，P＜0.01）。

Fig 1 24 h-urine protein levels between PAN model group and fenofibrate treated group**P＜0.01 vs PAN

2.2 非諾貝特降低足細胞損傷標記物的轉錄和表達水平 在PAN誘導足細胞損傷后，足細胞損傷標志物Desmin較空白對照組轉錄和表達水平明顯增加；給予非諾貝特治療后，Desmin轉錄和表達蛋白水平均較 PAN組下降（Fig 2，A、B，P＜0.01）。免疫熒光結果進一步證實這一變化（Fig 2，C）。

Fig 2 Effect of fenofibrate on podocyte injury markerA：Effectof fenofibrate on expression of desmin；B：Effectof fenofibrate on transcription activity of desmin；C：Immunofluorescence photomicrographs of desmin.**P＜0.01 vs PAN；##P＜0.01 vs CON

2.3 非諾貝特改善足細胞骨架相關蛋白的蛋白表達及轉錄活性 足細胞遭受損傷后往往會產生一些代償性變化如肥大，以維持正常的功能。我們為了探索PPAR-α的激活對這一變化的影響，所以檢測了與細胞肥大相關的細胞骨架基因的轉錄水平。Real-Time PCR結果顯示，足細胞骨架蛋白vimentin的蛋白表達和轉錄活性在PAN誘導足細胞損傷后均明顯增加，其中轉錄水平達到空白對照組的兩倍左右，而在非諾貝特處理后，基因轉錄活性和蛋白表達明顯下降（Fig 3，A）。此外，足細胞其他骨架蛋白nestin和 α-actinin的轉錄水平和 vimentin相一致（Fig 3，B、C）。足突相互連接形成的裂孔隔膜是腎小球濾過屏障選擇性濾過的主要決定因素之一［5］，也是腎小球濾過機械屏障的關鍵。本研究中，我們檢測足突裂孔隔膜相關蛋白的轉錄活性，發現模型組中，podocin、ZO-1的轉錄水平增加，其中podocin的轉錄活性達到空白對照組的2.5倍。在非諾貝特組，podocin、ZO-1恢復到空白對照水平。但裂孔隔膜蛋白nephrin的轉錄水平并沒有明顯變化（結果未顯示）（Fig 3，D、E）。

2.4 非諾貝特抑制凋亡相關基因的表達和轉錄活性 足細胞凋亡是足細胞損傷重要的病理特征，因此，我們檢測了凋亡通路中的關鍵因子的轉錄水平，探索非諾貝特對于足細胞凋亡的影響。結果顯示，PAN造模后，凋亡因子caspase-3的蛋白表達及其活性片段含量明顯增加，給予非諾貝特處理后caspase-3蛋白表達及其活性片段含量明顯減少，基本恢復到空白對照組水平，其基因轉錄水平和蛋白表達趨勢統一（Fig 4A，P＜0.01）。bax基因轉錄活性變化與caspase-3相一致，在非諾貝特處理后明顯下調（Fig 4B，P＜0.01）。而凋亡保護性因子bcl-2的轉錄水平并沒有明顯變化（結果未顯示）。另外，有研究顯示，TGF-β／Smad信號通路激活和 p38通路的激活都會足細胞產生凋亡，因此，在本研究中我們同時檢測了TGF-β／Smad-7和p38通路的活性。PAN誘導足細胞損傷后，TGF-β／Smad-7通路轉錄活性達到空白對照組的兩倍以上（Fig 4C、D，P＜0.01）；經過非諾貝特治療后，TGF-β和Smad-7的轉錄水平較PAN模型組下降31%和37%。（Fig 4，C、D，P＜0.01）。p38的結果和 TGF-β／Smad-7基因結果一致（Fig 4，E）。

Fig 3 Effect of fenofibrate on podocyte cytoskeletal and junction proteinA：Expression and transcription activity of vimentin；B，C：Transcription activity of nestin and ZO-1；D，E：Transcription activity of podocin andαactinin.##P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs PAN

Fig 4 Effect of fenofibrate on podocyte apoptosisA：Expression and transcription activity of caspase-3；B：Transcription activity of Bax；C，D：Transcription activity of TGF-β／Smad-7；E：Transcription activity of p38.##P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs PAN

3 討論

本研究通過PAN建立大鼠腎小球足細胞損傷模型，探索非諾貝特在PAN誘導的腎小球足細胞損傷中的作用。結果顯示PAN誘導足細胞損傷后，尿蛋白水平明顯增加，足細胞損傷標志物Desmin表達和轉錄明顯上調，表明足細胞損傷模型成功建立，而給予非諾貝特進行治療可以明顯減少尿蛋白的排泄，下調desmin轉錄和表達活性，恢復足細胞骨架蛋白和裂隙膜蛋白的蛋白表達和轉錄水平，明顯抑制細胞線粒體凋亡通路和TGF-β／Smd-7通路和p38信號通路的轉錄和轉錄活性，改善足細胞損傷。因此，我們的研究表明非諾貝特對PAN引起的大鼠足細胞損傷具有保護作用，能夠改善蛋白尿水平，其機制與抑制足細胞凋亡通路有關。

嘌呤霉素常常被用來構建腎病大鼠模型，該模型是研究微小病變型腎（MCNS）和局灶節段性腎小球硬化的理想動物模型，其最主要的臨床特征為大量蛋白尿［6］，足細胞損傷和凋亡是PAN大鼠模型另一個重要的病理表現。越來越多的研究表明PPAR-α具有腎臟保護作用［7］，在小鼠中PPAR-α的激活可以改善DOX導致足細胞損傷。另外，其他研究表明貝特類藥物能夠通過激活PPAR-α，減少順鉑和阿霉素引起的腎小管損傷。在動物實驗中，PPAR-α缺失導致對腎小球腎炎的敏感性增加［7］。我們的研究顯示，通過靜脈注射PAN誘導大鼠足細胞損傷，引起大鼠尿蛋白水平的明顯增加，而在給予非諾貝特進行治療后，尿蛋白水平減輕。Desmin蛋白是一種細胞骨架絲蛋白，其可作為足細胞損傷的標志性蛋白［8］，正常情況下Desmin蛋白在腎小球足細胞無明顯表達，當足細胞因各種原因發生損傷時可大量表達，其可能原因是足細胞骨架重新排列。我們的研究中，PAN處理后，Desmin的轉錄和表達均明顯上升，而在非諾貝特治療后則明顯下降，與尿蛋白的變化趨勢一致。

此外，我們還檢測了足細胞骨架蛋白和裂隙膜蛋白在PAN處理后的變化。結果顯示，PAN處理后足細胞骨架蛋白vimentin的轉錄和表達水平明顯上調，其他骨架蛋白nestin、α-actinin的變化與其一致，這可能是因為PAN誘導足細胞損傷后，一些足細胞發生凋亡，剩余的足細胞為了覆蓋裸露的基底膜（GBM）而產生代償性肥大，以阻止蛋白從裂孔中漏出［9］；非諾貝特治療后，足細胞的損傷和凋亡程度減輕，足細胞代償性肥大減少，骨架蛋白的的轉錄活性下降。此外，裂孔隔膜是腎小球濾過屏障選擇性濾過的主要決定因素之一，因此我們探索了非諾貝特治療PAN足細胞損傷過程中對裂隙膜蛋白的影響，Real-time PCR結果顯示，在PAN處理后podocin、α-actinin的轉錄水平明顯增加，在非諾貝特處理后其轉錄活性下降，可能的機制是PAN誘導足細胞損傷和凋亡后，裂孔隔膜遭到破壞，導致相關蛋白代償性轉錄增加，非諾貝特治療后損傷減輕，因此裂孔隔膜相關蛋白轉錄下降。但是nephrin的轉錄活性在PAN處理后未產生明顯變化，推測裂孔隔膜中nephrin并非PAN的損傷靶點。

在PAN大鼠足細胞損傷模型中，足細胞凋亡是其常見的重要病理特征［7］。在體外實驗中，PAN仍可以誘導體外小鼠足細胞凋亡。因此，本研究中我們檢測了非諾貝特對凋亡通路表達和轉錄活性的影響。結果表明，線粒體凋亡通路中caspase-3在PAN處理后表達和轉錄活性明顯增加，非諾貝特處理后的蛋白表達和轉錄活性受到明顯抑制，而bax的結果則進一步顯示了非諾貝特在線粒體凋亡通路中的作用，因此推測非諾貝特可能通過下調線粒體凋亡通路，減少足細胞的損傷和凋亡進而產生保護作用。此外，許多研究表明TGF-β在腎小球疾病中具有重要作用，TGF-β對腎小球細胞的增生、肥大、凋亡以及局部和全身免疫反應具有重要作用，而且TGF-β是腎小球硬化 （FSGS）的重要介質［7，10］，TGF-β／Smad信號通路激活是足細胞凋亡重要的啟動因素［7，11］。本研究的結果和以前研究一致，PAN誘導足細胞損傷后，TGF-β和Smad-7的轉錄水平明顯增加，達到空白對照組的兩倍以上，而非諾貝特的治療則明顯降低了TGF-β和Smad-7的轉錄水平，這提示TGF-β／Smad信號通路可能也是非諾貝特發揮足細胞保護作用的作用靶點。最后，以前的研究顯示p38的激活可以在體外誘導大鼠足細胞的凋亡［12］，因此本研究也初步探索了非諾貝特對于p38的影響，發現p38轉錄活性在PAN誘導足細胞損傷后明顯上調，經非諾貝特處理后則受到抑制，這表明非諾貝特可能也通過p38信號通路產生保護作用。

綜上所述，PPAR-α激動劑非諾貝特對足細胞損傷具有重要的保護作用，其機制可能是通過抑制凋亡通路的活性而產生。本研究為非諾貝特在臨床的新用途提供了有力的實驗支持。然而，非諾貝特抑制足細胞損傷引起的腎小球疾病的具體作用機制仍需進一步深入研究。

參考文獻：

［1］ Mundel P，KrizW.Structure and function of podocytes：An update［J］.Anat Embryol，1995，192（5）：385-97.

［2］ Park CW，Kim H W，Ko S H，et al.Accelerated diabetic nephropathy inmice lacking the peroxisome proliferator-activated receptor alpha［J］.Diabetes，2006；55：885-93.

［3］ Park CW，Zhang Y，Zhang X，etal.PPAR-alpha agonist fenofibrate improves diabetic nephropathy in db／db mice［J］.Kidney Int，2006，69：1511-7.

［4］ Zhou Y，Kong X，Zhao P，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-αis renoprotective in doxorubicin-induced glomerular injury［J］.Kidney Int，2011，79（12）：1302-11.

［5］ Arif E，Rathore Y S，Kumari B，et al.Slit diaphragm protein Neph1 and its signaling：a novel therapeutic target for protection of podocytes against glomerular injury［J］.JBiol Chem，2014，289（14）：9502-18.

［6］ Seckin I，Uzunalan M，Kokturk S，et al.Experimentally induced puromycine aminonucleoside nephrosis（PAN）in rats：evaluation of angiogenic protein platelet-derived endothelial cell growth factor（PD-ECGF）expression in glomeruli［J］.J Biomed Sci，2012，19（1）：24.

［7］ Wen D，Li Y，Zhang Q，et al.Upregulation of nestin protects podocytes from apoptosis inducedby puromycin aminonucleoside［J］.Am JNephrol，2011，34：423-34.

［8］ Floege J，Alpers C E，Sage E H，et al.Markers of complementdependent and complement-independent glo-merular visceral epithelial cell injury in vivo［J］.Expression of antiadhesive proteins and cytoskeletal changes J．Lab Invest，1992，67（4）：486-97.

［9］ 李衛國.足細胞對損傷的反應［J］.臨床兒科雜志，2012，30（4）：1091-4.

［9］ LiW G.Podocyte response to injury［J］.J Clin Pediatr，2012，30（4）：1091-4.

［10］劉國元.TGF-B1與腎小球硬化關系的研究［J］.國外醫學·泌尿系統分冊，2002，22（6）：361-4.

［10］Li Y G.Relationsbetween TGF-β1 and glomerulosclerosis［J］.Foreign Med Sci（Urol Nephrol Foreign Med Sci），2002，22（6）：361-4.

［11］Lee H S，Song C Y.Effects of TGF-beta on podocyte growth and disease progression in proliferative podocytopathies［J］.Kidney Blood Press Res，2010，33（1）：24-9.

［12］Chen C，LiangW，Jia J，et al.Aldosterone induces apoptosis in rat podocytes：Role of PI3-K／Akt and p38MAPK signaling pathways［J］.Nephron Exp Nephrol，2009，113（1）：e26-34.