PLCε對人骨肉瘤細胞遷移侵襲影響的實驗研究

吳金霞，曹文嘉，桑苗苗，鄭駿年，3，裴冬生

（徐州醫(yī)學院1.腫瘤生物治療實驗室、2.生理學教研室、3.附屬醫(yī)院臨床腫瘤中心，江蘇徐州 221002）

磷脂酶Cε（phospholipase C epsilon，PLCε）是一種新型磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC），于2001年由Song等［1］發(fā)現(xiàn)而獲得。由于PLCε是近幾年新發(fā)現(xiàn)的PLC家族成員，目前國外對PLCε的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域功能上，而對其在腫瘤學方面的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)［2］，PLCε因為同時具有RasGEF和RA結(jié)構(gòu)域而作為Rho和Ras的小GTP酶類效應(yīng)分子，在G蛋白偶聯(lián)受體 （G protein-coupled receptors，GPCRs）參與溶血磷脂酸和凝血酶調(diào)控磷酸肌醇過程中發(fā)揮重要作用。在皮膚化學性致癌的兩個階段，佛波酯可啟動攜帶活化ras癌基因的細胞進行克隆擴增，而缺乏Ras／Rap效應(yīng)子PLCε-／-的小鼠則表現(xiàn)出對皮膚癌腫瘤形成的抵抗，佛波酯不能誘導(dǎo)基底細胞增殖和表皮增生［3］。這些現(xiàn)象提示PLCε可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，PLCε與骨肉瘤的關(guān)系及對骨肉瘤細胞侵襲性研究尚未見報道。本研究擬探討PLCε對U2OS細胞遷移侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤細胞株U2OS為本實驗室保存，購自中國科學院上海細胞庫。新生牛血清為杭州四季青公司，siRNA轉(zhuǎn)染試劑SilectFect Lipid Reagent為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。Transwell小室購自美國Corning公司。PLCεsiRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。兔抗人PLCε抗體購自Upstate生物科技有限公司，抗人 β-actin一抗購自美國 Santa Cruz公司。熒光二抗羊抗鼠、羊抗兔IgG購自美國Licor公司，熒光二抗孵育后條帶由Odyssey掃描儀掃描處理。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染 待細胞處于50%～70%密度時進行，用SilectFect Lipid Reagent轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。4～6 h后換成含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48 h后提蛋白進行Western blot檢測。PLCε的siRNA序列如下：

Name siRNA duplexes si-Control：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′si-PLCε#1： 5′-CCCUGAUAAUUGUGAUGAUTT-3′5′-AUCAUCACAAUUAUCAGGGTT-3′si-PLCε#2： 5′-GCGGUACAAUUCCCAAGAATT-3′5′-UUCUUGGGAAUUGUACCGCTT-3′si-PLCε#3： 5′-GGCUGUCGAAGUGUAGAAUTT-3′5′-AUUCUACACUUCGACAGCCTT-3′

1.2.2 Western blot檢測PLCε在U2OS細胞中的表達

1.2.2.1 細胞總蛋白的提取 取轉(zhuǎn)染后的U2OS，加入冰浴的細胞裂解buffer（含20 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1KCl，0.5 mmol·L-1EDTA，1.5 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-1PMSF，2 mmol·L-1DTT，2.5 mmol·L-1CaCl2及 NP-40、甘油等，pH 7.5），冰上孵育。每5 min用渦旋儀振蕩1次，共振蕩6次。4℃，15 000×g離心15 min，吸取上清。

1.2.2.2 Western blot檢測 以上述細胞總蛋白為樣品，配制6%的聚丙烯酰胺凝膠，每個加樣孔中依次加入待測樣品。電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，用抗PLCε抗體4℃孵育過夜，加入熒光羊抗兔IgG的二抗，經(jīng)Odyssey掃描儀檢測PLCε在腫瘤細胞的表達。以siRNA-Control作為對照。

1.2.3 細胞增殖活性的檢測 取轉(zhuǎn)染PLCεsiRNA后的骨肉瘤細胞，制成單細胞懸液（1×104·L-1），接種至96孔板，每孔100μl，每組細胞設(shè)5個復(fù)孔。37℃和5%CO2實驗條件下常規(guī)培養(yǎng)。于d 1、2、3、4各取出一塊96孔板進行檢測。每孔加入CCK-8 10μl，37℃培養(yǎng)2 h后，酶標儀上檢測450 nm處的吸光度數(shù)值。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 劃痕實驗 轉(zhuǎn)染PLCεsiRNA后的骨肉瘤細胞接種到6孔板中，控制密度在80%左右，待細胞完全貼壁后換用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，使細胞休克，停止增殖。用2.5μl槍頭在6孔板內(nèi)劃兩條相互垂直的線，PBS洗去脫落的細胞，并在劃痕旁邊做標記，用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。選取0、6、12、18和24 h做為時間點，每隔6 h在倒置顯微鏡下拍照1次。

1.2.5 Transwell小室遷移實驗 細胞轉(zhuǎn)染同前，在超凈臺中將Transwell chamber下室背面均勻的鋪上FN膠，風干2 h后置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過夜。胰酶消化收集細胞，用無血清培養(yǎng)基制成6×104cells·L-1的細胞懸液150μl，加入Transwell小室的上室，下室加入600μl含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在孵育箱中培養(yǎng)12 h。然后，室溫甲醇固定，PBS漂洗，結(jié)晶紫染色。用濕棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細胞后，顯微鏡下隨機取5個視野拍照，計數(shù)并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.6 明膠酶譜實驗 細胞轉(zhuǎn)染同前，轉(zhuǎn)染后48 h換成無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。次日收集上清液，將上清液移入離心管，2 000 r·min-1離心10 min，BCA法測定各樣品蛋白濃度。根據(jù)不同濃度確定樣品的上樣體積，保證各樣品上樣的蛋白質(zhì)量相同，與4×上樣緩沖液混合，電泳，分別置于孵育液、洗脫液、脫色液中處理，顯現(xiàn)MMP2位于藍色背景上的透亮帶。用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積，寬度和灰度值，進行統(tǒng)計分析。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 Western blot、Transwell小室實驗及明膠酶譜實驗各重復(fù)3次實驗結(jié)果，采用t檢驗或單因素方差分析，假設(shè)檢驗水準按α＝0.05判定。

2 結(jié)果

2．1 沉默 PLCε后 PLCε蛋白水平明顯降低Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，PLCε基因的特異性干擾片段si-PLCε#1、si-PLCε#2和si-PLCε#3均能使細胞PLCε蛋白表達量在一定程度上降低，而si-PLCε#3使PLCε蛋白下降的最為明顯（Fig 1）。因此之后用于沉默PLCε的實驗均選用si-PLCε#3。

Fig 1 Effect of PLCεknockdown on protein levels of PLCε**P＜0.01 vs si-Ctrl（n＝3）

2．2 PLCε沉默后對骨肉瘤細胞增殖活性的影響U2OS細胞轉(zhuǎn)染si-PLCε#3后，使用CCK-8法檢測siCtrl組和siPLCε組在不同時間點的增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siPLCε組與siCtrl組相比，各個時間點細胞的增殖活性差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，F(xiàn)ig 2）。

Fig 2 Effect of PLCεknockdown on U2OS cell proliferation

2．3 PLCε沉默后對細胞劃痕愈合能力的影響 在轉(zhuǎn)染si-PLCε#3 48 h后，用細胞劃痕實驗檢測沉默PLCε對細胞劃痕愈合速度的影響。結(jié)果顯示，在0 h，siCtrl組和siPLCε組U2OS細胞的遷移距離無明顯差異，而24 h后，siPLCε組相對于siCtrl組細胞遷移距離有所減慢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，F(xiàn)ig 3）。提示沉默PLCε能抑制細胞的遷移能力。

Fig 3 Effect of PLCεknockdown on wound healing ability of osteosarcoma cells（×100）*P＜0.05 vs si-Ctrl（n＝3）

2．4 PLCε沉默抑制細胞的遷移能力 實驗結(jié)果顯示，在沉默PLCε48 h后，沉默組遷移的細胞相對于siCtrl組明顯減少，遷移細胞的百分比由100%下降到47.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示PLCε對骨肉瘤細胞的遷移能力可能具有重要調(diào)節(jié)作用（Fig 4）。

2．5 沉默 PLCε降低細胞對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2的分泌 明膠酶譜實驗檢測結(jié)果顯示，抑制PLCε的表達后骨肉瘤細胞分泌MMP2的量明顯減少。灰度分析其MMP2表達量由100%減少到44%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明沉默PLCε能下調(diào)細胞對MMP2的分泌（Fig 5）。

3 討論

Fig 4 Effect of PLCεknockdown on cellm igration（×200）**P＜0.01 vs si-Ctrl（n＝3）

Fig 5 Effect of PLCεknockdown on secretion of MMP2 in osteosarcoma cells**P＜0.01 vs si-Ctrl（n＝3）

骨肉瘤是最常見的原發(fā)骨惡性腫瘤，多發(fā)于四肢長管狀骨干骺端，尤其是股骨遠端、脛骨近端和肱骨近端。肺轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。近年來，雖然骨肉瘤的治療技術(shù)和手段有了一定發(fā)展，但骨肉瘤的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一［4］。

Shibatohge等發(fā)現(xiàn)一種能與Ras蛋白相結(jié)合的新型磷脂酶 C，相對分子質(zhì)量為210 ku，命名為PLC210［5］。隨后在哺乳動物中克隆出與PLC210同源序列的PLC，命名為PLCε。PLCε除具有與其它PLC家族成員典型的催化結(jié)構(gòu)域（X，Y）和C2結(jié)構(gòu)域外，還具有特異性RA結(jié)構(gòu)域和CDC25結(jié)構(gòu)域。CDC25結(jié)構(gòu)域位于PLCε的N端，具有鳥嘌呤核苷酸交換活性，可通過 H-Ras激活 MAPK途徑［6］。CDC25的鳥嘌呤核苷酸交換活性也能使Rap1A磷酸化，從無活性的 Rap1A-GDP變成有活性的Rap1A-GTP而被激活，活化的Rap1A進一步激活下游B-Raf和有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），引起酶促級聯(lián)反應(yīng)，最后激活ERK［7］。位于 PLCεC端兩個并聯(lián)排列的RA結(jié)構(gòu)域（RA1和RA2），為Ras激活PLCε的作用區(qū)域。作為新發(fā)現(xiàn)的PLC的同工酶，PLCε在腫瘤中的研究報道較少。

Li等［8］報道PLCε可通過擴大炎癥及血管形成促使Apc（Min／+）大鼠腸癌的發(fā)生。Bai和 Oka等［9，10］發(fā)現(xiàn) PLCε可能與皮膚癌的增殖有關(guān)，此作用在星形膠質(zhì)瘤細胞中也得到驗證［2］。Bourguinon等［11］研究表明，CD44激活 RhoA-PLCε生成 IP3，引起細胞內(nèi) Ca2+釋放以及 Ca2+／鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）上調(diào)，從而導(dǎo)致細胞骨架蛋白絲蛋白磷酸化。絲蛋白磷酸化后可降低與絲狀肌動蛋白的相互作用，而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。Yu等［12］發(fā)現(xiàn)PLCε在胃癌中高表達，而且其表達量與腫瘤的惡性程度、侵襲能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在中國哈薩克族人群食管鱗狀上皮癌的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)［13］。由此推測，PLCε在腫瘤的遷移和侵襲中扮演著重要角色。

為研究PLCε下調(diào)對骨肉瘤細胞遷移侵襲的影響，本研究使用siRNA，將其轉(zhuǎn)染入U2OS細胞發(fā)揮基因沉默的作用。對照組及PLCε沉默組分別檢測其蛋白表達水平變化，同時檢測細胞增殖能力、劃痕愈合能力、遷移能力及分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的情況。結(jié)果顯示siRNA成功轉(zhuǎn)染入U2OS骨肉瘤細胞，能特異性使PLCε的蛋白表達量下降。PLCε的下調(diào)對腫瘤細胞增殖無明顯影響，卻可明顯降低骨肉瘤細胞的劃痕愈合能力和遷移能力。降解細胞外基質(zhì)和破壞基底膜是惡性腫瘤向遠端侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟。MMPs是這一過程中的關(guān)鍵性酶。MMP2屬于MMPs家族成員，能降解細胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用［14-15］。而沉默 PLCε后骨肉瘤細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2的水平明顯下降。本研究顯示PLCε下調(diào)對骨肉瘤細胞的遷移侵襲有明顯的抑制作用，經(jīng)PLCε沉默處理的細胞侵襲力和遷移力明顯降低。其分子機制可能是通過減少U2OS細胞對MMP2的分泌，從而降低其對細胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致細胞遷移力降低。我們的實驗結(jié)果提示PLCε參與調(diào)控骨肉瘤細胞的遷移侵襲，對人骨肉瘤細胞的侵襲及遷移能力可能存在一定正性調(diào)控作用。

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