體外活細胞定向遷移研究方法的建立

蔡文杰，王銘潔

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院醫學基礎教研室，上海 200093；2.復旦大學上海醫學院生理與病理生理學系，上海 200032）

趨化是指細胞隨環境中化學物質的分布梯度作定向運動的現象［1］。許多細胞具有感受環境中趨化因子的能力，從而產生特定的生理與病理生理現象。比如細菌釋放炎癥因子，中性粒細胞感知后能朝向炎癥部位運動，最終到達該部位，發揮吞噬功能，起到免疫防護作用［2］。在創傷修復、組織再生、干細胞歸巢以及腫瘤轉移等過程中也都存在趨化現象［3］。本研究通過建立活細胞定向遷移研究平臺，探索在體外評價細胞運動和趨化能力的標準，為細胞遷移信號通路的研究提供實驗方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 蔡司倒置顯微鏡，Eppendorf顯微操縱儀、顯微注射儀和毛細管針，腔室蓋玻片（丹麥NUNC公司）。HL-60細胞株（ATCC），DMSO、牛血漿來源纖連蛋白、N-甲酰甲硫氨酰－亮氨酰－苯丙氨酸（N-formylmethionyl-leucylphenyl-alanine，fMLP）和 AS605240（美國 SIGMA公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘導HL-60細胞株成為中性粒細胞 人原髓細胞白血病細胞株（HL-60）在體積分數為0.20的胎牛血清－RPMI 1640培養液中常規培養，用體積分數為0.013的 DMSO處理細胞5～6 d，誘導其分化為中性粒細胞。

1.2.2 慢病毒介導基因表達 把PH-Akt-GFP克隆到慢病毒表達載體FUW2中，將其與另外3個質粒pMDL、pRSV、pCMV同時轉染293T細胞，2～3 d后將培養液超速離心得到病毒顆粒。慢病毒感染HL-60細胞后通過流式細胞術分選陽性細胞，最終得到表達PH-Akt-GFP的穩轉株。

1.2.3 準備供成像的活細胞 中性粒細胞離心后用改良HBSS緩沖液（137 mmol·L－1NaCl，4 mmol·L－1KCl，1.2 mmol·L－1MgCl2，10 mmol·L－1glucose和 20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4）洗滌，再次離心后用含質量分數為0.2%的BSA緩沖液重懸細胞，接種于預先用100 mg·L－1人纖連蛋白包被的腔室蓋玻片，置于37℃培養箱中孵育15～20 min，換液后去除未貼壁細胞。

1.2.4 準備顯微鏡和顯微注射系統 趨化因子（1μmol·L－1fMLP）用 0.22μm濾膜過濾，離心 5 min（10 000 r·min－1）去除未溶解雜質。毛細管針內注入10μl fMLP后安裝于顯微注射儀上，鏡下確認針尖端通暢且無氣泡。

1.2.5 顯微成像 研究單細胞遷移和趨化時，采用低倍（100～200倍）光鏡拍攝，圖像采集間隔為30～60 s。研究信號分子和骨架的動態分布時，采用高倍（400～630倍）熒光顯微鏡（或者激光共聚焦）拍攝，圖像采集間隔為5 s到10 s。

1.2.6 數據評價 用遷移速度（motility speed）、趨化速度（chemotaxis motility）、趨化指數（chemotaxis index）和持續性（persistency）來評價采集到的數據。得到的結果以ˉx±s表示，統計學分析采用單因素方差分析方法比較組間差異。

2 結果

2.1 fMLP可促進中性粒細胞隨機遷移 無fMLP處理的HL-60遷移速率為（1.40±0.28）μm·min－1，fMLP處理后細胞遷移速率明顯增加，達到（5.94±0.38）μm·min－1，見Fig 1。

2.2 fMLP可誘導中性粒細胞定向遷移 在未放置含1 μmol·L－1fMLP的毛細管針時，細胞隨機運動。當把毛細管針放置到觀察視野中心位置底面時候，很快引起細胞出現暫時性的鋪展。在2 min內，細胞分辨出fMLP的方向，開始朝向毛細管針遷移，直到到達針尖處（趨化因子濃度最高點）。見Fig 2。

2.3 AS605240抑制中性粒細胞定向遷移 細胞預先使用PI3K抑制劑 AS605240（10μmol·L－1）或其溶劑 DMSO處理30min，然后將含1μmol·L－1fMLP毛細管針放置到視野中，開始記錄細胞的遷移情況。用Image J軟件分析趨化的各種指標，發現AS605240處理后的細胞與對照組細胞相比，遷移速度降低（1.94±0.21）vs（3.12±0.24）μm·min－1，趨化速度降低（0.51±0.13）vs（1.01±0.21）μm·min－1，趨化指數減少（0.19±0.03）vs（0.36±0.05），持續性變差（0.29±0.04）vs（0.47±0.05），且差異皆有統計學意義（Fig 3）。

Fig 1 fMLP promotes random migration of HL-60 neutrophils（n＝21）A：Control；B：100 nmol·L－1 fMLP treated.P＜0.01.

Fig 2 Directional migration of HL-60 neutrophils towards fMLP gradientA：0 min；B：1.5 min；C：24 min；D：Migrating tracks.

Fig 3 AS605240 inhibits directional migration of HL-60 neutrophils towards fMLP gradientA：Migration track of DMSO treated cells；B：Migration track of AS605240 treated cells；C：Statistics of motility speed and chemotaxis speed；D：Statistics of chemotaxis index and persistency.*in A and B indicates the location of micropipette.In C and D，*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group.

2.4 信號分子標記物在活細胞中的動態分布 含1μmol·L－1fMLP毛細管針放置到視野中后，引起細胞膜PIP3產生增加，PH-Akt-GFP熒光標記物轉位到細胞膜上；1 min后，PIP3的產生主要發生在細胞前端朝向高濃度fMLP處；重置毛細管針引起fMLP濃度梯度方向的改變，進而導致PH-Akt-GFP熒光標記物發生重定位，朝向新的濃度梯度（Fig 4）。

Fig 4 PIP3 probe PH-Akt-GFP relocate with fMLP micropipetteA：10 sec；B：1 min；C：Relocation of the micropipette.*indicates the location of micropipette.Arrows show local accumulation of PH-Akt-GFP on the plasma membrane.

3 討論

趨化通常包括方向感知、細胞極化和運動3個過程［4］，但這幾個過程并不是完全獨立的，而是相輔相成的。細胞通過膜上的趨化受體感知外界信號，通過信號轉導通路，把環境中微弱的趨化因子濃度差異轉換為細胞膜上明顯的信號分子分布差異，進一步使細胞內與運動相關的分子進行重分布，細胞出現形態上變長，其中一端成為前端，另一端成為后端或稱為尾端。前端的信號蛋白如Rac等引起肌動蛋白聚合［5］，后者又通過一種正反饋機制激活 PI3K，使得極性增強。PI3K活化后催化PIP2生成PIP3，PIP3可以結合蛋白的PH功能域，因此，當細胞過表達PH功能域后就可以實時監測細胞PI3K的活化狀況［6］。中性粒細胞對fMLP的反應以PI3Kγ的激活最為重要［7］，因此，當利用了 PI3Kγ特異性的抑制劑AS605240后，細胞的趨化能力明顯降低。

評價細胞趨化能力的常用指標有遷移速度、趨化速度、趨化指數和持續性［8］，其中，遷移速度是指細胞在單位時間內實際遷移了多少距離，趨化速度是指細胞在單位時間內向趨化源遷移了多少有效距離，趨化指數是指趨化速度除以遷移速度得到的商，持續性是指起點和終點的直線距離除以遷移的總距離。這些指標綜合起來可以較好地反映出細胞對趨化源的反應能力和自身的趨化能力。

目前，常用的檢測細胞遷移的方法有細胞劃痕實驗、Transwell小室遷移實驗等［9］，這些方法簡單有效，不需要特殊的儀器設備，缺點是數據比較籠統，反映的是群體遷移，不能完全排除細胞增殖的影響，不能分辨出細胞對所加藥物是否具有趨化性。在我們的實驗中，藥物通過毛細管針緩慢釋放，維持一定的濃度梯度，從而可以很好地觀察細胞對藥物的反應能力，而且，我們是對單細胞進行動態觀察，因此得到的信息量很大，可以進行多種后續分析。但該方法對顯微鏡要求比較高，需要得到高質量的圖像，這樣才能通過軟件把細胞與背景區分開，實現數據的自動分析。雖然在我們的實驗中用的是快運動細胞，但相關方法也同樣適用于慢運動細胞的趨化，因此，該方法應用前景廣泛。

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