角膜組織塊培養法建立ICR小鼠蠶蝕性角膜潰瘍體外模型

閆 瑩，朱孔梅，楊 鑒，姚景春

（1.臨沂市人民醫院眼科，山東臨沂 276000；2.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，魯南制藥集團股份有限公司新藥藥理中心，山東臨沂 273400）

蠶蝕性角膜潰瘍在臨床上比較常見，但病因尚沒有完全研究清楚，多數學者認為該病可能是體液免疫為主、細胞免疫為輔的自身免疫性疾病。免疫抑制劑或者聯合球結膜切除術具有一定的效果［1－2］，具有免疫抑制或免疫干預活性的中藥有效成分可能會是治療蠶蝕性角膜潰瘍的潛在有效藥物，但動物篩選模型的匱乏成為此類藥物研發的制約環節。角膜缺乏血液循環，白細胞能夠浸潤到角膜組織的難度較大，因此，相關免疫性損傷的動物模型制作困難。故本試驗嘗試使用在體外將小鼠角膜細胞和自身白細胞共培養的方法，通過觀察小鼠角膜細胞體外生長情況，建立蠶蝕性角膜潰瘍的體外動物模型，可為研發治療該疾病的藥物打下基礎。

1 材料

1.1 動物及分組 SPF級ICR小鼠，♀♂各半，體質量（20±2）g，魯南制藥集團股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號：0015255。隨機分成3組，設正常對照組、皮下免疫組、環磷酰胺給藥組，每組10只。飼養于屏障環境。1.2 主要試劑及儀器 曲拉通（國藥集團化學試劑有限公司，S20120321），生理鹽水（辰欣藥業股份有限公司，1201228202），完全弗氏佐劑（中國獸醫藥品監察所，201201），環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，12041825），戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司，P3761），RPMI 1640細胞培養液（Gibco，1204685），CKX31顯微鏡（OLYMPUS），BB15培養箱（THERMO），FHS-2型可調高速勻漿器（江蘇榮華）。

2 方法

2.1 動物造模方法 取兔眼角膜，剪碎后，加入5～10倍體積的5%曲拉通溶液，高速勻漿至無塊狀顆粒，將勻漿液3 000 r·min－1離心10 min，取上清液。將5 ml上清液與5 ml完全弗氏佐劑劇烈震蕩混合制成混合液。皮下免疫組和環磷酰胺給藥組每只小鼠背部皮下注射混合液0.5 ml，隔日注射1次，連續注射10次，正常對照組不注射混合液。在皮下免疫的同時，正常對照組與皮下免疫組背部皮下注射生理鹽水0.5 ml／只，環磷酰胺給藥組背部皮下注射環磷酰胺300 mg·kg－1，給藥部位與注射混合液部位不重疊。

2.2 角膜組織塊體外培養 末次給藥3 d后，小鼠采血后處死，摘取眼球，在解剖顯微鏡下小心剝離眼角膜，將小鼠的角膜剪碎，注意無菌操作和剪取的角膜大小一致。將角膜與自身血液中分離的白細胞在24孔培養板中共同培養，每只小鼠的角膜設4個復孔，24 h換液1次，仔細觀察小鼠眼角膜組織塊狀態與角膜細胞的長出情況。

3 結果

每孔角膜細胞的長出率使用SPSS軟件進行χ2檢驗。正常對照組小鼠眼角膜細胞72 h和120 h長出率分別為25.0%和37.5%，皮下免疫組均為0.0%，明顯低于正常對照組（P＜0.01），環磷酰胺給藥組長出率分別為12.5%和17.5%，明顯高于皮下免疫組（P＜0.05）。具體結果見Tab 1。

Tab 1 Growth of cornea cell in serum free cornea explants culture

4 討論

蠶蝕性角膜潰瘍是一種自身免疫性疾病，在病因或者遺傳方面還沒有完全研究清楚［3］，患者體內存在抗角膜基質中自身免疫性抗原的抗體［4］。患者角膜潰瘍處和相鄰的結膜有大量的巨噬細胞和T淋巴細胞浸潤，同時潰瘍角膜和相鄰結膜上皮異常高表達VCAM-1［5］。給小鼠皮下注射含有新西蘭兔角膜膠原蛋白的佐劑，可通過分子模擬，打破小鼠對自身角膜膠原蛋白的免疫耐受，引起自身反應性T、B淋巴細胞的擴增，進一步引起角膜的免疫損傷。我們通過多次試驗，仍然觀察不到皮下免疫ICR小鼠的自身免疫性角膜損傷，因而無法成功制備蠶蝕性角膜潰瘍模型，這可能與角膜細胞很難與血液循環中的淋巴細胞接觸有關。

為了將自身反應性淋巴細胞與角膜細胞有效地接觸，本實驗將小鼠白細胞與自身角膜細胞共培養，觀察角膜的生長情況。發現正常對照組小鼠眼角膜上皮細胞120 h后長出率可達37.5%，而皮下免疫組長出率為0.0%，說明針對自身角膜的自身反應性淋巴細胞在與角膜共培養的過程中，對角膜細胞產生了免疫性損傷，成功模擬到蠶蝕性角膜潰瘍的免疫損傷。環磷酰胺給藥組角膜細胞長出率為17.5%，明顯高于皮下免疫組，這與臨床上免疫抑制劑治療蠶蝕性角膜潰瘍有一定效果相吻合［1－2，6－7］。

中藥是免疫干預活性有效成分的天然寶庫，有很多的成分等待我們去挖掘發現，本文所建立的體外模型，將會促進中藥有效成分的篩選與開發。

參考文獻：

［1］ 謝漢平，陳家祺，林躍生，等.FK506滴眼液聯合角膜移植術治療復發性蠶蝕性角膜潰瘍［J］.中華眼科雜志，2002，38（1）：13－5.

［1］ Xie H P，Chen J Q，Lin Y S，et al.Effect of FK506 eye-drop combined with keratoplasty on recurrent Mooren′s ulcer［J］.Chin J Ophthalmol，2002，38（1）：13－5.

［2］ 王翠青，岳愛環.環磷酰胺聯合球結膜切除治療蠶蝕性角膜潰瘍［J］.山東大學基礎醫學院學報，2005，19（3）：190－1.

［2］ Wang C Q，Yue A H.Cyclophosphamide combined with bulbar conjuctivectomy for rudent corneal ulcer［J］.J Preclin Med Coll Shandong Univ，2005，19（3）：190－1.

［3］ 王青松，袁 進，陳家祺，等.中國漢族人群蠶蝕性角膜潰瘍與HLA-Cw等位基因的相關性研究［J］.眼科研究，2009，27（6）：514－6.

［3］ Wang Q S，Yuan J，Chen JQ，et al.Association of Mooren’s ulcer and HLA＿Cw alleles in Chinese Han population［J］.Chin Ophthal Res，2009，27（6）：514－6.

［4］ Gottsch J D，Liu S H，Minkovitz J B，et al.Autoimmunity to a cornea associated stromal antigen in patients with Mooren＇s ulcer［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，3（6）：1541－7.

［5］ 謝漢平，陳家棋，鄭湖鈴，等.蠶蝕性角膜潰瘍角膜及鄰近球結膜的組織病理和免疫組化研究［J］.眼科學報，2000，1（6）：139－42.

［5］ Xie H P，Chen J Q，Zheng H L，et al.A histochemical and immunohistochemical study of cornea and adjacent bulbar conjunctiva in Mooren’s ulcer［J］.Eye Sci，2000，1（6）：139－42.

［6］ Tandon R，Chawla B，Verma K，et al.Outcome of treatment of mooren’s ulcer with topical cyclosporine A 2% ［J］.Cornea，2008，27（9）：859－61.

［7］ Tiev K P，Borderie V M，Briant M，et al.Severe moorens ulcer：efficacy of monthly cyclophosphamide intravenous pulse treatment［J］.Rev Med Interne，2003，24（2）：118－22.

［8］ 王 錚，陳家祺.蠶蝕性角膜潰瘍的病因和治療研究進展［J］.國外醫學·眼科學分冊，1992，16（6）：349－52.

［8］ Wang Z，Chen JQ.Progress in research of etiology and therapy of mooren’s ulcer［J］.Sect Ophthalmol Foreign Med Sci，1992，16（6）：349－52.