激動(dòng)ALDH2對(duì)抗糖尿病大鼠肝臟損傷的機(jī)制探討

張冠軍，康品方，宗巧鳳，于 影，王芳芳，高 琴

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽蚌埠 233004）

糖尿病是一種慢性進(jìn)行性?xún)?nèi)分泌及代謝性疾病，隨著生活水平的提高，其發(fā)病率越來(lái)越高，目前全球糖尿病患者已超過(guò)7億。糖尿病作為一種慢性疾病嚴(yán)重危害著人們的身體健康。糖尿病的病程較長(zhǎng)，在其病情不斷加重的過(guò)程中伴有多種并發(fā)癥，肝臟損傷是其中之一，主要表現(xiàn)為慢性炎癥和肝功能的損傷［1］。

乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是線(xiàn)粒體內(nèi)重要的醛類(lèi)氧化酶，與生物氧化關(guān)系密切，可防止乙醛對(duì)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，是機(jī)體內(nèi)重要的保護(hù)因子之一［2］。ALDH2廣泛分布于肝臟、心臟、肺臟和腦等組織中。Murata等［3］觀察到少量或適量的外源性乙醇可以激動(dòng)ALDH2的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室前期已觀察到激動(dòng)ALDH2可以減輕糖尿病大鼠心肌損傷［4］。氧化應(yīng)激異常是糖尿病肝損傷發(fā)生慢性炎癥和肝功能損傷的重要機(jī)制［1］，糖尿病大鼠肝組織中由于過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性降低，不能及時(shí)清除氧自由基，引起肝細(xì)胞DNA損傷的發(fā)生［5］。大量研究顯示，線(xiàn)粒體ALDH2具有抗氧化應(yīng)激損傷的作用，但激動(dòng)ALDH2是否對(duì)糖尿病大鼠的肝臟損傷有保護(hù)作用至今報(bào)道較少。Martinovic等［5］在對(duì)糖尿病大鼠肝臟的研究中觀察到：在肝功能損害的過(guò)程中存在著JNK（c-Jun N-terminal kinase）通路的激活。Kaneto等［6］觀察到 JNK抑制劑使小鼠血糖降低且并發(fā)癥減少。激動(dòng)ALDH2是否可通過(guò)抑制JNK通路減弱糖尿病誘導(dǎo)的肝臟的損傷呢？因此，本實(shí)驗(yàn)建立糖尿病大鼠肝臟損傷模型，應(yīng)用低劑量乙醇激動(dòng)ALDH2使之高表達(dá)，觀察ALDH2高表達(dá)是否可對(duì)抗糖尿病肝臟損傷，并進(jìn)一步觀察激動(dòng)ALDH2能否通過(guò)抑制JNK通路而對(duì)抗糖尿病肝臟損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康♂SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，蘇州工業(yè)園區(qū)愛(ài)爾麥特科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇2009-001）。

1.1.2 儀器、藥品和試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)自 Sigma公司，批號(hào)：905B0311；乙醇（ethanol，EtOH）購(gòu)自安徽安特食品股份有限公司，批號(hào)：1212073601；ALDH2、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；p-JNK、JNK抗體購(gòu)自 Anbo公司；羊抗小鼠及羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore公司。采用易速得血糖分析儀及配套的臺(tái)欣試紙測(cè)定大鼠空腹血糖變化；立式超低溫冰箱（海爾公司，中國(guó)），酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)），水平低溫離心機(jī)（Centrifuge 5810R，美國(guó)），電泳儀（Bio-RAD，美國(guó) ），電轉(zhuǎn)槽（Bio-RAD，美國(guó)）；全自動(dòng)凝膠分析儀（Chmi DocTMXRS+，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型復(fù)制及分組 ♂SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，每組10只，分為正常對(duì)照組（Con組）、糖尿病組（DM組）、ALDH激動(dòng)劑乙醇加糖尿病組（EtOH+DM組）。一次性腹腔注射STZ 55mg·kg-1復(fù)制糖尿病大鼠模型，72 h后尾靜脈取血，測(cè)空腹血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol·L-1且持續(xù)1周確定為模型復(fù)制成功［7］。DM組大鼠給予正常飲食，EtOH+DM組待大鼠糖尿病模型造模成功后給予體積分?jǐn)?shù)為0.025的乙醇適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，體積分?jǐn)?shù)為0.05的乙醇持續(xù)喂養(yǎng)至8周。正常對(duì)照組大鼠常規(guī)飲食，不做任何處理，持續(xù)喂養(yǎng)8周。

1.2.2 空腹血糖及糖化血紅蛋白（HbA1c）檢測(cè) 8周后，清晨稱(chēng)量大鼠空腹體重，尾靜脈取血，測(cè)定空腹血糖（FBG）水平，水合氯醛麻醉后頸總動(dòng)脈取血1.5 ml，置于肝素抗凝管中，室溫靜置30 min，離心4 000 r·min-1，5 min，分離紅細(xì)胞，測(cè)定糖化血紅蛋白（HbA1c）水平。

1.2.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定肝功能 麻醉狀態(tài)下，頸總動(dòng)脈取血3 ml至肝素抗凝管中，送至蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的含量。

1.2.4 肝組織病理學(xué)檢查 大鼠處死后，速取肝臟并稱(chēng)重，計(jì)算肝重指數(shù)（肝臟重量／體重）。于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫蝗〔糠指闻K，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.2.5 Western blot檢測(cè)肝臟組織ALDH2、JNK蛋白表達(dá) 取0.1 g肝臟組織勻漿，4℃離心（12 000 r·min-1，30 min），BCA法測(cè)定蛋白濃度，以總蛋白0.08 mg上樣，使蛋白變性，配膠，電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉 2 h，TBS稀釋一抗 ALDH2（1∶500）、JNK、p-JNK（1∶1 000），加一抗，水浴搖床，4℃過(guò)夜。次日水浴搖床，TBS洗膜4次。ECL試劑顯色，曝光成像。凝膠成像系統(tǒng)測(cè)量條帶的灰度值，計(jì)算 ALDH2／β-actin，p-JNK／β-actin、JNK／βactin、p-JNK／JNK蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，各組間采用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）水平、肝重指數(shù)（肝臟重量／體重）的變化與Con組大鼠相比，DM組和EtOH+DM組大鼠的FBG、HbA1c水平、肝重指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與DM組相比，EtOH+DM組的FBG、HbA1c水平、肝重指數(shù)明顯降低（P＜0.05～0.01），見(jiàn) Tab 1。

Tab 1 Changes of fasting blood glucose（FBG）and glycosylatedhemoglobin（HbA1c）levels and LW／BW in different groups

2.2 各組大鼠肝功能的測(cè)定 與Con組比較，DM組和EtOH+DM組大鼠血清ALT和AST含量明顯升高（P＜0.05～0.01）；與DM組比較，EtOH+DM組大鼠血清ALT、AST含量降低（P＜0.01），見(jiàn) Tab 2。

Tab 2 Changes of serum ALT and AST levels in different groups

2.3 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示：Con組大鼠肝組織中肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索整齊排列，偶見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。DM組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞邊界不清，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞索排列紊亂，假小葉形成，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。EtOH+DM組與DM組相比細(xì)胞形態(tài)尚正常，肝細(xì)胞腫脹、肝小葉的破壞和假小葉的形成均有明顯的改善（Fig 1、2）

2．4 W estern blot檢測(cè)肝臟組織 ALDH2、JNK、p-JNK蛋白表達(dá) DM組大鼠肝臟ALDH2蛋白表達(dá)水平明顯低于Con組（P＜0.01），EtOH+DM組大鼠肝臟 ALDH2蛋白表達(dá)明顯高于 DM組（P＜0.01），見(jiàn) Fig 3。

與Con組相比，DM組大鼠肝臟p-JNK、JNK蛋白的表達(dá)均明顯增高，p-JNK／JNK比值增加（P＜0.01）；與 DM組相比，EtOH+DM組大鼠肝臟 p-JNK、JNK蛋白的表達(dá)均明顯降低，p-JNK／JNK比值下降（P＜0.01），見(jiàn) Fig 4。

Fig 1 Pathology of liver of diabetic rats in different groups（×100） A：Con；B：DM；C：EtOH+DM

Fig 2 Pathology of liver of diabetic rats in different groups（×400） A：Con；B：DM；C：EtOH+DM

Fig 3 Representative W estern blot（A）and quantitative analysis of ALDH2／β-actin protein expression（B）in liver of diabetic rats**P＜0．01 vs Con；##P＜0．01 vs DM.

Fig RepresentativeW estern blot（A）and quantitative analysis of the ratio ofpan／β-actin（D）protein expression in liver of diabetic rats**P＜0．01 vs Con；##P＜0．01 vs DM.

3 討論

糖尿病作為一種慢性進(jìn)行性?xún)?nèi)分泌及代謝性病，主要表現(xiàn)為其復(fù)雜的并發(fā)癥對(duì)身體健康造成嚴(yán)重的危害。糖尿病肝損傷是其慢性并發(fā)癥之一，同時(shí)，在疾病的發(fā)展過(guò)程中慢性肝損傷也可以影響糖代謝，加重糖尿病病情，形成惡性循環(huán)。糖尿病肝病后期會(huì)增加肝硬化、肝癌的發(fā)生率。因此，探討糖尿病肝病發(fā)生機(jī)制，研究其可能的治療措施，對(duì)于改善糖尿病患者的預(yù)后具有重要意義。

臨床了解肝功能主要是通過(guò)檢測(cè)血清中ALT、AST、ALP、血清總膽紅素（TB）等的水平。正常細(xì)胞由于細(xì)胞膜的包裹，ALT和AST不會(huì)釋入血中。肝細(xì)胞受到損害后，細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞膜破碎或細(xì)胞膜的通透性增加，肝細(xì)胞中所含的ALT和AST就會(huì)被釋放到血液中，使血中ALT、AST水平增加。本實(shí)驗(yàn)觀察到DM大鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白水平均上升，血清ALT、AST水平增高，提示糖尿病誘發(fā)了肝功能損傷。

ALDH2是重要的內(nèi)保護(hù)因子，與生物氧化關(guān)系密切。Ohta等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2活性缺失型PC12細(xì)胞更容易受到脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷，且細(xì)胞存活率低。俞佳艷等［9］也觀察到ALDH2基因高表達(dá)可有效地抑制急性心肌梗死后心衰小鼠心肌細(xì)胞的凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病引起代謝紊亂，會(huì)使糖原在肝組織堆積，游離脂肪酸過(guò)多進(jìn)入肝組織，導(dǎo)致肝微血管病理性損傷，進(jìn)一步可能會(huì)出現(xiàn)脂肪肝或肝硬化等一系列的肝損傷［10］。本研究中觀察到糖尿病大鼠肝功能降低，HE染色顯示小葉結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞邊界不清，腫脹，假小葉形成，可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)，肝臟ALDH2表達(dá)降低，提示糖尿病引起的肝臟損傷可能與肝臟ALDH2的表達(dá)降低有關(guān)。給予ALDH2激動(dòng)劑低劑量乙醇干預(yù)后，血清中ALT、AST濃度降低，病理改變有所減輕，肝臟ALDH2的表達(dá)增加，提示激動(dòng)ALDH2可改善糖尿病大鼠肝功能，對(duì)肝臟有保護(hù)作用。

JNK屬于促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases，MAPK）一族。JNK可以被生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞應(yīng)激等激活。糖尿病代謝紊亂導(dǎo)致的高血糖、高血脂使細(xì)胞內(nèi)活性氧生成增加或清除不足，機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，進(jìn)而激活JNK通路，使JNK磷酸化為p-JNK。Kohl等［11］在實(shí)驗(yàn)中觀察到：糖尿病大鼠肝臟損傷的過(guò)程中JNK蛋白表達(dá)明顯增加。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到：與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠肝組織 ALDH2表達(dá)降低的同時(shí)，p-JNK、JNK蛋白的表達(dá)均明顯增高，p-JNK／JNK比值增加，提示糖尿病引起肝臟ALDH2的降低可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激加重，使得JNK和p-JNK表達(dá)增加，加重糖尿病肝臟損傷；與糖尿病組相比，乙醇干預(yù)后大鼠肝臟ALDH2表達(dá)增加，p-JNK、JNK蛋白的表達(dá)均明顯降低，p-JNK／JNK比值下降，提示激動(dòng)ALDH2后可能通過(guò)降低JNK的活性，進(jìn)而降低對(duì)糖尿病大鼠肝臟的損傷。

Moon等［12］對(duì)暴露在四氯化碳中的大鼠研究發(fā)現(xiàn)，四氯化碳可以通過(guò)活化JNK，進(jìn)而抑制ALDH2的活性，并最終導(dǎo)致肝臟的嚴(yán)重?fù)p傷。其研究說(shuō)明JNK與ALDH2之間確實(shí)存在一定關(guān)系，從另一角度也間接支持了本文觀點(diǎn)。

當(dāng)然，高濃度乙醇對(duì)肝臟的損傷作用更為大家熟識(shí)，報(bào)道甚多。邱萍等［13］研究指出，長(zhǎng)期大量飲酒可增加體內(nèi)ROS含量，從而加重肝臟氧化應(yīng)激，并發(fā)生炎癥、壞死和纖維化等病理改變。王喜軍等［14］使用體積分?jǐn)?shù)為0.5的乙醇誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型。而本實(shí)驗(yàn)中我們采用體積分?jǐn)?shù)為0.025和0.05的低劑量乙醇，結(jié)果顯示，給予低劑量乙醇干預(yù)，糖尿病大鼠肝功能有所恢復(fù)，提示該濃度乙醇未加重肝臟損傷，反而起到保護(hù)作用。同時(shí)觀察到肝臟ALDH2表達(dá)增高，p-JNK／JNK比值下降，提示低劑量乙醇作為ALDH2的激動(dòng)劑對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用，后期實(shí)驗(yàn)中我們將選用利于臨床應(yīng)用的ALDH2特異性激動(dòng)劑并進(jìn)一步觀察其保護(hù)作用，為臨床糖尿病引起的肝損傷提供新的治療手段。

因此，我們得出結(jié)論，ALDH2蛋白對(duì)糖尿病大鼠肝臟有保護(hù)作用；激動(dòng)ALDH2的表達(dá)可能通過(guò)抑制JNK通路的活化，減輕肝臟損傷。ALDH2如何調(diào)控JNK通路發(fā)揮保護(hù)作用，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Moriyama M，Hayashida JN，Toyoshim T，et al.Cytokine／chemokine profiles contribute to understanding the pathogenesis and diagnosis of primary Sj?gren′s syndrome［J］.Clin Exp Immunol，2012，169（1）：17-26.

［2］ Higuchi S，Matsushita S，Masaki T，et al.Influence of genetic variations ofethanolmetabolizing enzymes on phenotypes of alcoholrelated disorders［J］.Ann NY Acad Sci，2004，10（25）：472-80.

［3］ Murata C，SuzukiY，Muramatsu T，etal.Inactive aldehyde dehydrogenase 2 worsens glycemic control in patientswith type2 diabetesmellitus who drink low to moderate amounts of alcohol［J］.Alcohol Clin Exp Res，2000，24（4）：5s-11s.

［4］ Gao Q，Wang H J，Wang X M，et al.Activation of ALDH2 with ethanol attenuates diabetes inducedmyocardial injury in rats［J］.Food Chem Toxicol，2013，56：419-24.

［5］ Martinovic V，Grigorov I，Bogojevic D，et al.Activation level of JNK and Akt／ERK signaling pathways determinates extent of DNA damage in the liver of diabetic rats［J］.Cell Physiol Biochem，2012，30（3）：723-34.

［6］ Kaneto H，NakataniY，Miyatsuka T，etal.Possiblenovel therapy for diabeteswith cell-permeable JNK-inhibitory peptide［J］.Nature Med，2004，10（10）：1128-32.

［7］ 王洪巨，康品方，葉紅偉，等.激動(dòng)乙醛脫氫酶2對(duì)抗糖尿病大鼠心肌缺血／在再灌注損傷的作用［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（2）：133-7.

［7］ Wang H J，Kang PF，Ye HW，etal.Effectof ALDH2 activation against myocardial ischemia／reperfusion injury in diabetic rat［J］.Chin JApplied Physiol，2012，28（2）：133-7.

［8］ Ohta S，Ohsawa I，Kamino K，et al.Mitochondrial ALDH2 Deficiency as an Oxidative Stress［J］.Ann New York Acad Sci，2004，10（11）：36-44.

［9］ 俞佳艷，孫愛(ài)軍，賈建國(guó)，等.轉(zhuǎn)染乙醛脫氫酶2基因?qū)π募」Ｋ篮笮乃バ∈笮墓δ艿挠绊懀跩］.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2008，15（3）：277-80.

［9］ Yu JY，Sun AG，Jia JG，etal.Effectsof acetaldehyde dehydrogenase 2 transfection on acutemyocardial infarction induced heart failure in C57BL／6mouse［J］.Chin JClin Med，2008，15（3）：277-80.

［10］Menendez JA，Vazquez-Martin A，Ortega F J，F(xiàn)ernandez-Rea J M.Fatty acid synthase：association with insulin resistance，type 2 diabetes，and cancer［J］.Clin Chem，2009，55（3）：425-38.

［11］Kohl T，Gehrke N，Schad A，etal.Diabetic liver injury from streptozotocin is regulated through the caspase-8 homolog cFLIP involving activation of JNK2 and intrahepatic immunocompetent cells［J］.Cell Death Dis，2013，4：e712.

［12］Moon K H，Lee YM，Song B J.Inhibition of hepaticmitochondrial aldehyde dehydrogenase by carbon tetrachloride through JNK-mediated phosphorylation［J］.Free Radic BiolMed，2010，48（3）：391-8.

［13］邱 萍，李 相，孔德松，等.酒精性肝病發(fā)展機(jī)制研究的新進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（2）：160-3.

［13］Qiu P，Li X，Kong D S，et al.Research progress on pathogenesis of alcoholic liver disease［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30（2）：160-3.

［14］王喜軍，劉 蓮，孫 暉，等.乙醇誘導(dǎo)大鼠肝損傷的代謝組學(xué)和陳蒿湯的干預(yù)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24（4）：452-7.

［14］Wang X J，Liu L，Sun H，et al.Studies on themetabonomics of rat liverinjury induced by ethanol and interfering effects of Y in Chen Hao Tang［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24（4）：452-7.