齊留通通過激活ERK1／2信號通路減輕大鼠腦缺血炎癥反應和缺血性腦損傷

涂獻坤，石松生，楊衛忠，陳建屏，陳 琰，王立勝

（福建醫科大學附屬協和醫院神經外科，福建省神經外科研究所，福建福州 350001）

炎癥反應是介導缺血性腦損傷最重要的病理生理機制之一，并且炎癥反應已被廣泛認為是治療缺血性腦中風的重要靶點［1］。本課題組前期研究發現，5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）抑制劑 zileuton通過抑制炎癥反應減輕大鼠缺血性腦損傷［2］。在腦缺血中，ERK1／2被認為一種促神經細胞生存的信號通路，研究表明，神經保護劑Leptin通過激活ERK1／2信號通路減輕缺血性腦損傷［3］，但是 5-LOX抑制劑zileuton是否通過調節ERK1／2信號通路減輕腦缺血誘導的炎癥反應及缺血性腦損傷，目前尚未見報道。本實驗對此進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TTC染料購自美國Amersco公司，MPO檢測試劑盒購自南京建成生物公司，ELISA試劑盒購自廈門泰京生物公司，PD98059購于Promega公司，Zileuton來自湖北鑫順源醫藥化工，p-ERK1／2和 t-ERK1／2抗體購于Santa Cruz公司，蛋白提取試劑盒及檢測試劑盒購于碧云天生物技術公司，水合氯醛由福建醫科大學附屬協和醫院提供。

1.2 動物分組、動物模型制備及腦室內注射 清潔級♂SD大鼠，體質量250～300 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。隨機將大鼠分為4組，即對照組（sham）、腦缺血+溶媒處理組（MCAO）、腦缺血+zileuton治療組（zileuton）和腦缺血+zileuton治療+PD98059干預組（PD98059）。腦缺血后，zileuton 50 mg·kg-1用生理鹽水稀釋（無水酒精助溶），通過灌胃給藥，該劑量參考本課題組前期發表論文［2］。

腦缺血動物模型參考課題組前期工作［4］，采用直徑0.32 mm的尼龍魚線，10%水合氯醛（0.3 ml／100 g）腹腔注射麻醉，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈。在頸外動脈近分叉處剪一“V’形切口，插入備用魚線，用鑷子輕輕將栓線送至大腦中動脈起始處，平均進線（18.0±2.0）mm。

PD98059溶于DMSO，并用PBS稀釋成10μmol·L-1。在建立腦缺血模型時取10μl PD98059行腦室內注射，運用立體定向注射儀（深圳瑞奧德公司）。定向儀注射以前囟前方0.8 mm，中線外側1.5 mm為穿刺點，穿刺深度3.5 mm。

1.3 評估大鼠神經功能損傷程度 根據文獻報道的神經功能損傷評分方法［5］，對腦缺血24 h大鼠進行神經功能評分。0分，無神經功能障礙；1分，提起大鼠尾巴對側前肢屈曲；2分，行走時地上打轉，靜止時身體無偏向對側；3分，行走時地上打轉，靜止時身體也偏向對側；4分，嚴重意識障礙。

1.4 測量腦梗死體積 腦缺血24 h，取鼠腦，沿冠狀位將鼠腦切成6片（前囟前方2片，后方4片），每片厚度約2 mm，放在2%TTC溶液中避光孵育20 min。正常腦組織呈鮮紅色，梗死腦組織呈白色。利用Photoshop等軟件測量各腦片梗死面積，并按如下公式計算腦梗死體積，V＝t×（A1+A2+…An），V為梗死體積，t為腦片厚度，A為梗死面積；數據采集以腦梗死比作統計，腦梗死體積／%＝（手術對側半球的體積-手術側半球未梗死部分的體積）／手術對側半球的體積×100%。

1.5 分析缺血腦組織含水量 分析腦含水量可作為評估腦水腫的依據。腦缺血24 h，取鼠腦，用濾紙吸除腦表面的水珠，稱重可獲得濕重（wet weights，WW），放烤箱烤干后，再稱重獲得干重（dry weights，DW），腦含水量計算公式：H2O／%＝（WW-DW）／WW×100%。

1.6 檢測缺血腦組織髓過氧化物酶水平 髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是中性粒細胞的標志性物質，通過檢測MPO的活性可獲得中性粒細胞的浸潤程度，從而間接反映腦缺血炎癥反應的程度。腦缺血24 h取大鼠缺血腦組織，勻漿，按試劑盒說明書步驟操作，并計算MPO活性。

1．7 ELISA檢測血漿TNF-α的含量 腦缺血24 h，采集血液，3 000 r·min-1離心后15 min獲得上清，將標準蛋白樣品和待測樣品加入包被好一抗的96孔板，按試劑盒說明書步驟操作，最后測定OD值。根據已知濃度的標準蛋白的OD值繪制標準曲線，并根據標準曲線計算各待測樣品的TNF-α含量。

1．8 W estern blot法檢測大腦 p-ERK1／2和 t-ERK1／2的含量 腦缺血24 h，取大鼠缺血腦組織，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并測定蛋白濃度。經灌膠、上樣、凝膠電泳、轉膜等步驟后，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，然后經顯影、定影、圖像采集等，用Quantity one軟件分析蛋白條帶。

1.9 統計學處理 統計結果以表示，統計學方法采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較選用LSD法分析，用SPSS13.0統計軟件處理。

2 結果

2．1 Zileuton減輕神經功能損傷和腦梗死體積的作用被PD98059抑制 假手術組大鼠無神經功能障礙，腦缺血24 h大鼠神經功能損傷評分明顯增高（2.67±0.51，P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1治療組明顯減輕大鼠腦缺血誘導的神經功能損傷（1.5±0.54，P＜0.05），這種作用被 PD98059抑制（2.5±0.55，P＜0.05，n＝6）。

假手術組未見腦梗死，腦缺血24 h大鼠腦梗死比明顯增大（0.411±0.015，P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1治療組大鼠腦梗死比（0.228±0.036）明顯小于溶媒組腦梗死比（P＜0.05），這種作用被PD98059抑制（0.342±0.035，P＜0.05，n＝6）。

2．2 Zileuton減輕缺血性腦水腫的作用被PD98059抑制 大鼠腦缺血24 h缺血側腦組織含水量（84.7±3.1）%和假手術組（73.6±1.1）%相比明顯增高（P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1組（79.7±2.4）%明顯減小大鼠腦含水量（P＜0.01），這種作用被 PD98059抑制（82.1±1.8）%，（P＜0.05，n＝6）。

2．3 Zileuton降低MPO活性的作用被PD98059抑制 大鼠腦缺血24 h缺血腦組織MPO活性明顯增高（P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1可減輕缺血腦組織MPO的活性，即抑制腦缺血誘導的炎癥反應，這種抗炎癥反應作用被PD98059抑制（Tab 1）。

2．4 Zileuton降低TNF-α表達的作用被PD98059抑制 大鼠腦缺血24 h血漿TNF-α的水平增高（P＜0.01），zileuton 50 mg·kg-1可明顯降低血漿 TNF-α的水平，這種抑制TNF-α表達的作用被腦室內注射的PD98059抑制（Tab 1）。

Tab 1 Zileuton reduces MPO activity and TNF-αcontent in rats of cerebral ischem ia via modulating ERK 1／2 signaling pathway

Tab 1 Zileuton reduces MPO activity and TNF-αcontent in rats of cerebral ischem ia via modulating ERK 1／2 signaling pathway

**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MCAO group；△P＜0.05 vs zileuton-treated group.

Group MPO activity TNF-αcontent Sham 0.136±0.012 7.37±1.01 MCAO 0.475±0.024 20.7±2.58**Zileuton 50 mg·kg-1 0.356±0.052**#16.45±1.35**##LY294002+Zileuton 0.415±0.031**△ 19.97±2.1**△

2．5 Zileuton激活 ERK1／2信號通路的作用被PD98059抑制 大鼠腦缺血24 h缺血腦組織p-ERK1／2的蛋白表達明顯降低（P＜0.01），而 t-ERK1／2的蛋白表達不變（P＞0.05）。Zileuton 50 mg·kg-1明顯上調缺血腦組織p-ERK1／2的蛋白表達水平（P＜0.01），而對t-ERK1／2的蛋白表達沒有影響（P＞0.05）。Zileuton上調p-ERK1／2表達的作用被 PD98059抑制（P＜0.05），PD98059對 t-ERK1／2的蛋白表達沒有影響（P＞0.05），見 Fig 1。

Fig 1 Zileuton up-regulates the expression of p-ERK1／2 in rats of cerebral ischem ia，which is inhibited by PD98059 adm inistration±s，n＝6）*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs MCAO group；△P＜0.05 vs zileuton-treated group.

3 討論

急性缺血性腦中風的治療包括兩個方面：溶栓治療和神經保護治療［6］。阿替普酶是目前急性缺血性腦中風溶栓治療的最有效的藥物，但是溶栓治療的時間窗只有3～4.5 h［7］，這么短的治療時間窗導致了臨床上實際能夠接受溶栓治療的病人不足2.1%［8］。探索新的神經保護措施或神經保護藥物，提高缺血神經細胞的耐受性，彌補溶栓治療的不足，目前已成為全世界的研究熱點。我們前期研究發現，腦缺血后5-LOX表達增高，5-LOX抑制劑zileuton可抑制腦缺血5-LOX的表達從而減輕大鼠腦缺血損傷［9］，此外zileuton可抑制炎癥反應、血腦屏障破壞和神經元凋亡減輕缺血性損傷［2，10］，但其潛在的分子機制目前尚未完全明確。

本項研究利用已成功建立的大鼠腦缺血模型，借助腦立體定向儀將 ERK1／2的特異性抑制劑PD98059注射腦室內，用于干預ERK1／2信號通路。結果顯示，zileuton可減輕大鼠腦缺血誘導的神經功能障礙，減小腦梗死體積，減輕缺血性腦水腫，這3個方面說明zileuton可減輕大鼠缺血性腦損傷，對腦缺血具有神經保護作用。上述zileuton的3種作用均被腦室內注射的PD98059所抑制，這充分表明zileuton對腦缺血的神經保護作用和調節ERK1／2信號通路有關。已知zileuton通過抑制炎癥反應減輕缺血性腦損傷，本研究發現zileuton抗炎癥反應的作用也被腦室內注射的PD98059所抑制，這說明zileuton是通過調節ERK1／2信號通路減輕腦缺血炎癥反應。因此，5-LOX抑制劑是通過調節ERK1／2信號通路減輕炎癥反應，進而減輕缺血性腦損傷。

為了證實zileuton是如何調節ERK1／2信號通路，我們檢測了信號通路的關鍵蛋白p-ERK1／2和t-ERK1／2的蛋白表達水平，結果發現腦缺血后p-ERK1／2的表達下降，這和ERK1／2信號通路促神經細胞生存的說法是完全一致的，但t-ERK1／2的表達沒有變化，這和ERK1／2磷酸化激活的理論也是一致的［11］。Zileuton可以上調 p-ERK1／2的表達，對t-ERK1／2沒有影響，說明 zileuton激活腦缺血ERK1／2信號通路具備可能性；進一步研究發現zileuton上調p-ERK1／2表達的作用被腦室內注射的PD98059抑制，這說明zileuton通過激活ERK1／2信號通路并發揮生物學效應。因此，zileuton對腦缺血的神經保護作用和抗炎癥反應的作用是通過激活ERK1／2信號通路起作用。但是，zileuton的抗炎癥反應是否與其抑制5-LOX表達有關，目前沒有明確的結論。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種炎癥性細胞因子，在腦缺血性損傷的病理生理過程中起重要作用，可加重炎癥反應從而介導腦損傷［12］。腦缺血 TNF-α的表達升高，zileuton可抑制TNF-α的表達，這種作用也被腦室內注射的PD98059所抑制，這進一步表明zileuto的抗炎癥作用和ERK1／2信號通路的激活有關。綜上所述，zileuton通過激活ERK1／2信號通路減輕大鼠腦缺血炎癥反應和缺血性腦損傷。

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