不同產區龍井茶相似性及線性判別

王麗鴛，成 浩*，賀 巍，韋 康，張成才

（1. 中國農業科學院茶葉研究所國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008；2. 河南農業大學園藝學院，河南 鄭州 450002）

不同產區龍井茶相似性及線性判別

王麗鴛1，成 浩1*，賀 巍2，韋 康1，張成才1

（1. 中國農業科學院茶葉研究所國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008；2. 河南農業大學園藝學院，河南 鄭州 450002）

對來自西湖龍井一級保護區、西湖龍井二級保護區、錢塘產區、越州產區4個產區的527份龍井茶樣品進行了高效液相色譜測定和主成分分析及線性判別，結果表明：不同產區的龍井茶在兒茶素等酚性物質及咖啡堿含量上沒有顯著性差異；通過主成分分析，提煉出5個主成分，其中第一主成分構成中影響較大的因子有EGCG、EGC、C、CAF和EC，第二主成分構成中影響最大的因子為ECG；在第一第二主成分得分值平面中，樣品點基本按照品種聚合成群，說明原料品種不同是影響龍井茶的內含成分的主要因素之一；歐氏距離與判別分析結果顯示，二級保護區的西湖龍井茶與一級保護區西湖龍井茶之間的差異最大，越州龍井與一級保護區西湖龍井茶產品間差異較小。

龍井茶；相似性；高效液相色譜；線性判別

西湖龍井茶是中國的歷史名茶，歷史上其產區只包括杭州市西湖周邊不到50 km2的區域。從20世紀90年代開始，在杭州及周邊地區開始出現了仿西湖龍井茶的扁形茶產品。2001年，浙江省公布了《龍井茶原產地域保護管理辦法》，將浙江省內的龍井茶原產地域范圍劃分為西湖產區、錢塘產區和越州產區三大區塊。同時，杭州市頒布的《杭州市西湖龍井茶基地保護條例》又將原西湖區西湖鄉內的龍井茶基地規定為西湖龍井茶基地的一級保護區，屬西湖區的其余龍井茶基地為二級保護區。2005年7月15日，西湖龍井茶獲得了地理標志保護。由于采用的加工工藝十分相似，從外形、滋味、香氣等方面很難對不同地區龍井茶進行區分。目前，龍井茶，尤其是西湖龍井茶，受假冒偽劣產品的影響比較嚴重。因此，需要對不同產地龍井茶的化學組成差異進行分析，并建立龍井茶產地判別的方法。

在茶學研究上，早期的研究基本集中在對茶葉生化成分的定性和定量同時測定[1～4]。此后，開始有了對不同區域來源茶葉的成分組成進行分析辨別的努力[5～6]。相對來說，近紅外技術在茶葉成分的定性、定量預測，茶葉產品種類的辨別，茶葉產地的區分方面應用的比較多[7～18]。高效液相色譜（High-performance liquid chromatography，HPLC）是另一個對茶葉進行產區鑒別的分析方法。基于HPCL的化學定量分析，在食品產地鑒別的方面很有發展前景[19]。研究表明，利用HPLC化學成分檢測數據，可以對茶葉產區、原料品種等進行鑒別[20～24,5～6]。

本文采集了不同產區的大量龍井茶樣本，采用代謝組學的原理，對以兒茶素為主的酚性成分含量進行了液相色譜測定，然后對不同產區龍井茶的組分差異及相似性進行模式識別分析，并嘗試用線性判別方法對不同產區產品進行區分。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和標準品

試驗樣本為2009年春季收集的不同產區的84個取樣點的龍井茶樣品，共527個。按照GB/T18650-2008的規定，其中西湖龍井一級保護區茶樣（XHLJ1）174份，來自一級保護區內龍井村、梅家塢等10個自然村的27個取樣點；西湖龍井二級保護區茶樣（XHLJ2）56份，來自二級保護區的10個取樣點；錢塘龍井茶樣（QTLJ）137份，來自錢塘產區5個縣的20個取樣點；越州龍井茶樣（YZLJ）160份，來自越州龍井產區6個縣的27個取樣點。為減少樣品采摘期對龍井茶產地判別的干擾，從同一采樣點，收集采摘前期、中期、晚期的相同原料品種的龍井茶樣各1個，其中一個來自春茶開采后約第5天，一個來自開采后約第15天，另一個為第25天。樣本的原料品種為無性系品種龍井43（LJ43）和有性群體種（POPN）。

兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和咖啡堿（Caffeine, CAF）等標準品購于Sigma公司。

1.2 樣品測定

稱取3.000 g（粉碎）干茶樣，用50%甲醇室溫提取15 min后過濾。殘渣洗滌3次，合并濾液，定容到100 mL。液相色譜分析采用安捷倫1100 HPLC系統，4 μm Phenomenex RP-MAX C12反相柱，型號規格為250 mm×4.6 mm，柱溫40℃；A相為1%甲酸；B相為乙腈；梯度從4%B到25%B，流速1 mL/min，洗脫60 min，檢測波長280 nm[25]。

1.3 數據處理

咖啡堿、C、EGC、EC、EGCG、GCG和ECG等組分通過與標準品的比較確認。其他未得到辨認的酚性化合物和生物堿，通過比較保留時間和相對保留時間進行匹配。去除掉一些不夠穩定的小峰后，共保留26個HPLC峰用于分析。數理統計、主成分分析和線性判別分析采用 SPSS軟件進行；在線性判別分析中，對每類樣本采取隨機取二留一的方法劃分訓練集和驗證集。

2 結果與分析

2.1 不同產區龍井茶HPLC化學圖譜相似度分析

西湖龍井一級保護區（XHLJ1）、西湖龍井二級保護區（XHLJ2）、錢塘產區（QTLJ）和越州產區（YZLJ）4個產區樣品的26個面積較大的HPLC共有峰的峰面積平均值和標準差見表1。SPSS的ONE-WAY ANOVA檢驗表明，在α = 0.05水平下，不同產區龍井茶兒茶素等酚性化合物與生物堿HPLC含量在同一水平，沒有顯著性差異。

表1 4個產區龍井茶的兒茶素等酚性化合物與生物堿的HPLC平均峰面積

4個產區龍井茶HPLC組份的歐氏距離見表2。從表2可以發現，XHLJ1和XHLJ2之間的歐氏距離最大，QTLJ和YZLJ之間的歐氏距離最小。4個產區龍井茶HPLC組份的歐氏距離和地理距離不一致，XHLJ 1和XHLJ 2之間的地理距離最近的，而歐氏距離卻最大。

表2 4個產區龍井茶的HPLC化學組成的歐氏距離

2.2 龍井茶的主成分分析

對龍井茶的HPLC化學組分數據進行主成分分析，共提取出5個主成分（表3），累計貢獻率為94.2%，其中前兩個主成分的貢獻率分別為48%和23%（表3）。從表3可以發現，第一主成分（PC 1）的構成中，對主成分得分值影響較大的因子按系數大小降序為EGCG、EGC、P11、C、CAF和EC，體現了幾種主要兒茶素單體成分的影響力；在第二主成分（PC 2）的主要構成中，影響大小依次為ECG、P20、CAF、P3和P16，主要包含的是一些洗脫時間較長的組分。以各樣本第一、第二主成分得分值分別作為X坐標和Y坐標作圖（圖1），發現龍井茶按照品種的不同聚成兩個集團，龍井43品種樣本（LJ43）主要位于左上方，而群體種樣本（POPN）主要位于右下方（圖1A），說明原料品種是影響龍井茶內含成分關鍵性因素之一。但是，按照各樣本的第一、第二主成分得分值，未能將不同產地龍井茶分開（圖1B）。

表3 主成分的成分矩陣及貢獻率

表3續

圖1 龍井茶的第一、第二主成分得分值分布

2.3 不同產區龍井茶的線性判別

線性判別分析首先將分析樣本分為訓練集和驗證集兩部分，先用訓練集樣本建立判別模型，然后將訓練集中的樣本每次輪流抽走一個后重新建模，來判定建立的判別模型的穩定性，最后用驗證集樣本來驗證判別模型的適用性和正確率。對試驗數據進行線性判別分析，得到3個判別函數，其函數系數矩陣見表4。判別分析的結果表明（表5），117個西湖龍井一級保護區（XHLJ1）訓練集的建模樣本中，106個分類正確，10個被劃分為越州龍井，1個被誤判為錢塘龍井；交叉驗證的數據基本一致；而57個驗證集樣本，49個判定為XHLJ 1，8個判定為YZLJ。在西湖龍井二級保護區（XHLJ 2）的訓練集及其交叉驗證中，均有三分之一左右的樣本被認定成錢塘龍井（QTLJ），驗證集中更有近一半的樣本被認定成QTLJ。至于QTLJ，無論是訓練集還是其交叉驗證，或者是外部驗證，都有20% ～ 30%的樣本被分類成其他幾種類別。而YZLJ是判別正確率最高的一類，無論哪種情況，只有少量的樣本被判定到XHLJ 1或QTLJ中。

表4 典型判別式函數系數

以各樣本的判別函數值作圖，在前兩個判別函數值FUN 1和FUN 2的投射平面（圖2A）上，XHLJ 1位于左上，YZLJ位于左下，而XHLJ 2和QTLJ重疊在右邊；在FUN 1和FUN 3組成的投射平面上（圖2B）可以看到，XHLJ 1集中于最左邊的小塊區域內，YZLJ則更靠右一點，而XHLJ 2在右側集中于上部，而QTLJ較零落地分布在右下部。

圖2 4個產區龍井茶的判別分析

表5 判別分析結果

3 討論

由于不同加工工藝、原料嫩度對茶的品質成分有很大影響，因此不同種類茶的HPLC圖譜有較大的差異性,往往比較容易進行區分。而不同產區龍井茶及以龍井茶加工工藝制成的其他扁形茶，因其原料嫩度要求一致、加工工藝相同，其化學組成及 HPLC圖譜的相似度很高, 更難對同一茶類進行產區判別。本研究也發現，不同產區龍井茶在兒茶素、咖啡堿等化學成分的含量上沒有顯著性區別，而且HPLC圖譜的相似度高。

進一步的主成分分析結果表明，茶葉中最重要的幾類兒茶素單體是構成第一、第二主成分的主要因子。根據前兩個組分得分值，相同原料品種的龍井茶樣本聚在一起。這一結果進一步驗證的就是這樣一個事實：由于遺傳基礎的不同，不同茶樹品種所具有的特有的生化成分比例，可以影響成品茶的品質風味。因此，為了得到穩定的產品品質和特色，除加工工藝外，鮮葉原料也應該采用固定的茶樹品種或固定的品種搭配比例。這也說明，原料品種會對茶葉產區判別帶來較大的干擾。

此外，從不同產區龍井茶的歐氏距離結果可看到，地理距離最近的二級保護區的西湖龍井茶與一級保護區的西湖龍井茶之間的歐氏距離最大；而且在判別分析中，一級保護區與二級保護區的西湖龍井茶之間沒有誤判。這一結果說明，在被研究的幾類茶產品中，二級保護區的西湖龍井茶與一級保護區西湖龍井茶差異最大。相反，地理距離較遠的越州龍井與西湖龍井一級保護區間的歐氏距離反而最為接近，兩者間的互相誤判也相對較多。對這一結果的解釋，僅僅考慮地域分布是不夠的，可能需要從歷史傳統和加工技術細節等各方面來加以分析。西湖龍井二級保護區歷史上幾乎都是生產旗槍茶的，20世紀90年代以后才開始轉產龍井茶，直到本世紀初才正式劃入西湖龍井產區。旗槍茶與西湖龍井茶外形比較相像，都屬于扁形茶，但旗槍更為細長一些，加工工藝上，都有“青鍋”和“煇鍋”兩個工序，但旗槍以前還有“挺鍋”工序。這兩類茶產品雖然挺類似，但風格特征上仍然存在差異。這些工藝上的風格和習慣，在轉產龍井茶并劃入龍井產區后，不可避免的還會有一定程度的留存和影響，因此可能是造成這兩個產區產品之間存在一定差異的原因之一。而越州產品的龍井茶生產主要來自于上世紀90年代對西湖龍井歷史產區的學習和模仿，沒有歷史工藝的干擾和影響，因此可能在與西湖龍井一級保護區產品的區分上更為困難一些。

本文采用代謝組學原理和模式識別技術研究了龍井茶4個不同產區產品間的相似性和加以鑒別的可行性，雖然這一方法還不能正式用于茶產品產地的鑒別，但是在對于茶學研究中新思維和新技術手段的引進，對于現在越來越多的茶葉地理標志產品認定科學依據的探索，都有良好的推動作用。

[1] Goto T, Yoshida Y, Kiso M, et al. Simultaneous analysis of individual catechins and caffeine in green tea[J]. J Chromatogr A, 1996（749）：295－299.

[2] Horie H, Mukai T, Kohata K. Simultaneous determination of qualitatively important components in green tea using capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A, 1997（758）：332－335.

[3] Khokhar S, Magnusdotiir S G M. Total phenol, catechin, and caffeine contents of teas commonly consumed in the United Kingdom[J]. J Agr Food Chem, 2002（50）：565－570.

[4] Zuo Y G, Chen H, Deng Y W. Simultaneous determination of catechins, caffine and gallic acid in green, oolong, black and pu-reh teas using HPLC with a photodiode array detector[J]. Talanta, 2002（57）：307－316.

[5] Borse B B, Rao L J M, Nagalakshmi S, et al. Fingerprint of black teas from India: identification of the region-specific characteristics[J]. Food Chem, 2002（79）：419－424.

[6] Fernández P L, Pablos F, Martin M J, et al. Study of catechin and xanthine tea profiles as geographical tracers[J]. J Agr Food Chem, 2002（50）：1 833－1 839.

[7] Luypaert J, Zhang M H, Massart D L. Feasibility study for the use of near infrared spectroscopy in the qualitative and quantitative analysis of

green tea[J]. Anal Chim Acta, 2003（478）：303－312.

[8] Yan S H. Evaluation of the composition and sensory properties of tea using near infrared spectroscopy and principal component analysis[J]. J Near Infr Spectrom, 2005（13）：313－325.

[9] Zhao J W, Chen Q S, Huang X Y, et al. Qualitative identification of tea categories by near infrared spectroscopy and support vector machine[J]. J Pharm Biomed Anal, 2006（41）：1198－1204.

[10] Chen Q S, Zhao J W, Fang C H, et al. Feasibility study on identification of green, black and oolong teas using near-infrared reflectance spectroscopy based on support vector machine (SVM)[J]. Spectrochem Acta Part A, 2007（66）：568－574.

[11] He Y, Li X L, Deng X F. Discrimination of varieties of tea using near infrared spectroscopy by principal component analysis and BP model[J]. J Food Engineering, 2007（79）：1 238－1 242.

[12] Zhou J, Cheng H, He W, et al. Identification of geographical indication tea with Fisher's discriminant classfication and principal components analysis[J]. J New Infr Spectrom, 2009（17）：159－164.

[13] 周健，成浩，賀巍，等. 基于近紅外的PLS量化模型鑒定西湖龍井真偽的研究[J]. 光譜學與光譜分析，2009，29（5）：1 251－1 254.

[14] 周健，成浩，王麗鴛，等. 基于杠桿率校正的PLS-DA法對正半巖武夷巖茶的識別研究[J]. 茶葉科學，2009，29（1）：34－40.

[15] 周健，成浩，葉陽，等. 滇青、青餅和普洱茶(熟餅)近紅外指紋圖譜分析[J]. 核農學報，2009，23（1）：110－113.

[16] 周健，成浩，葉陽，等. 基于近紅外的Fisher分類法識別茶葉原料品種的研究[J]. 光學學報，2009，29（4）：1 117－1 121

[17] 周健，成浩，曾建明，等. 基于近紅外的多相偏最小二乘模型組合分析實現茶葉原料品種鑒定與溯源的研究[J]. 光譜學與光譜分析，2010，30（10）：2 650－2 653.

[18] He W, Zhou J, Cheng H, et al. Validation of origins of tea samples using partial least squares analysis and Euclidean distance method with

near-infrared spectroscopy data[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2012（86）：399－404.

[19] Berrueta L, Alonso－Salces R , & Héberger K. Supervised pattern recognition in food analysis[J]. J Chromatog A, 2007（1158）：196－214.

[20] 成浩，王麗鴛，周健，等. 基于化學指紋圖譜的綠茶原料品種判別分析[J]. 中國農業科學，2008，41（8）：2 413－2 418.

[21] 成浩，王麗鴛，周健，等. 基于化學指紋圖譜的扁形茶產地判別分析研究[J]. 茶葉科學，2008，28（2）：83－88.

[22] 王麗鴛，成浩，周健，等. 普洱茶的HPLC化學指紋圖譜分類研究[J]. 浙江林業科技，2009，29（1）：25－30.

[23] 王麗鴛，成浩，周健，等. 基于多元化學指紋圖譜的武夷巖茶身份判別研究[J]. 茶葉科學，2010，30（2）：83－88.

[24] 王麗鴛，成浩，周健，等. 綠茶數字化多元化學指紋圖譜建立初探[J]. 茶葉科學，2007，27（4）：335－342.

[25] Rio D D, Stewart A J, Mullen W, et al. HPLC-MS Analysis of phenolic compounds and purine alkaloids in green and black tea[J]. J Agr Food Chem, 2004（52）：2 807－2 815.

Similarity and Linear Analysis of Longjing Tea from Different Production Areas

WANG Li-yuan1，CHENG Hao1*，HE Wei2，WEI Kang1，ZHANG Cheng-cai1
（1. National Center for Tea Improvement, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. College of Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China）

In present study, totally 527 Longjing tea samples were collected from four production areas and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), combined with principal component analysis(PCA) and linear discriminant analysis(LDA). The result showed that 5 PCs could be extracted and the most important factors in the first PC composition were EGCG, EGC, C, CAF and EC. Meanwhile, the most important factor in the second PC was ECG. And in the score plot of the first two PCs, samples grouped according to the varieties of their fresh leaf material. On the other hand, the result of discriminant and Euclidean distance analysis suggested that the tea samples of Xihu Longjing secondary protection zone had the least similarity to those of primary protection zone. And compared to other two groups, the difference between Yuezhou Longjing and Xihu Longjing primary protection zone was the least.

Longjing tea; similarity; high performance liquid chromatography; linear discriminant analysis

S571.1

A

1001-3776（2014）02-0018-06

2013-08-30；

2014-01-16

浙江省重大科技專項（優先主題）農業項目（2008C12070）

王麗鴛（1978－），女，浙江金華人，副研究員，博士，從事茶樹生物工程與遣傳育種研究；*通訊作者。