尼可地爾、谷氨酰胺、美托洛爾單獨(dú)及合用對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心肌細(xì)胞抗凋亡和HSP70的影響

陳文華，孫 暢，張 穎，吳艷娜，溫 克，康 毅，婁建石

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津 300070）

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）即當(dāng)心肌較長(zhǎng)時(shí)間缺血造成一定程度損傷后，恢復(fù)供血不但不能減輕或逆轉(zhuǎn)損傷，反而加重?fù)p傷。MIRI表現(xiàn)為心肌舒縮功能降低、心肌結(jié)構(gòu)損壞、心律失常、心肌能量代謝障礙和超微結(jié)構(gòu)變化等。1986年，Murry等首次提出“缺血預(yù)適應(yīng)”（ischemia preconditioning，IPC）的概念，即反復(fù)短暫的心肌缺血會(huì)對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，使心肌對(duì)更長(zhǎng)時(shí)間缺血的耐受性增強(qiáng)［1］。目前認(rèn)為，IPC是一種非常有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，可刺激機(jī)體合成、釋放內(nèi)源性活性物質(zhì)。基于對(duì)這種保護(hù)性機(jī)制的認(rèn)識(shí)，研究人員用藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性活性物質(zhì)，以呈現(xiàn)IPC樣保護(hù)作用，稱為藥理性預(yù)適應(yīng)（pharmacological preconditioning，PP）。缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，但目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的藥理性預(yù)適應(yīng)大多仍是單藥物、單機(jī)制、單方面的。所以，針對(duì)這種情況，研究人員開始嘗試聯(lián)合用藥防治I/R損傷。細(xì)胞凋亡是MIRI的特征性改變［2-3］，細(xì)胞凋亡的數(shù)量決定著I/R損傷的輕重。熱休克蛋白［4］（heat shock protein，HSP）是機(jī)體在多種損傷性應(yīng)激原（如熱休克、缺血、創(chuàng)傷、病原體感染）應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一類內(nèi)源性保護(hù)蛋白。HSP70作為其中一個(gè)亞型，在防止應(yīng)激引起的細(xì)胞損害以及修復(fù)受損的細(xì)胞方面發(fā)揮著重要的作用［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用尼可地爾、美托洛爾、谷氨酰胺三種藥物，觀察單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥對(duì)大鼠MIRI后心肌細(xì)胞抗凋亡能力和保護(hù)性蛋白HSP70表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 尼可地爾（陜西力邦制藥公司，批號(hào)：030604）；美托洛爾（天津市藥物研究院，批號(hào)：091203）；丙氨酰谷氨酰胺注射液（華瑞制藥有限公司，批號(hào)：80DK32）；RIPA組織/細(xì)胞裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，批號(hào)：201211043）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天，批號(hào)：201201022）；鼠單克隆抗體β-actin（Santa Cruz）；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、兔抗鼠Bcl-2均購自 Santa Cruz（批號(hào)分別為：96996、97380、J2511）；兔抗鼠Bax（Abcam分裝，批號(hào)：70163）；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Roche，德國(guó)）；蛋白酶 K（Roche，德國(guó)）；鼠單克隆抗體 HSP70（Santa Cruz，批號(hào)：3097-100）。

1.1.2 儀器 BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；外科手術(shù)器械（上海醫(yī)療器械有限公司）；電泳儀和電泳槽（BIO-RAD，USA）；WK-9580B型水平搖床（北京六一儀器有限公司）；2050型自動(dòng)石蠟切片機(jī)（Sigma，德國(guó)）；H22110型切片烘干機(jī)（Leica，德國(guó)）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Wistar♂健康大鼠104只，體質(zhì)量（250±10）g，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為7組。①假手術(shù)組（Sham group，n＝8）：麻醉后開胸手術(shù)前，腹腔注射 NS（5ml·kg-1，與給藥組等體積），30min后實(shí)施開胸手術(shù)、冠狀動(dòng)脈LAD穿線，不結(jié)扎；②缺血/再灌注損傷組（I/R group，n＝16）：麻醉后開胸手術(shù)前，腹腔注射NS（5 ml·kg-1，與給藥組等體積），30 min后實(shí)施I/R程序；③ 尼可地爾組（Nic group，n＝16）：麻醉后開胸手術(shù)前，腹腔注射給予1 mg·kg-1即 1 ml·kg-1（藥物濃度為 1 g·L-1）的Nic＋4 ml·kg-1NS，30 min后實(shí)施 I/R程序；④ 谷氨酰胺組（Glu group，n＝16）：麻醉后開胸手術(shù)前，腹腔注射給予1 mg·kg-1（藥物濃度為1 g·L-1）的 Glu＋4 ml·kg-1NS，30 min后實(shí)施 I/R程序；⑤美托洛爾組（Met group，n＝16）：麻醉后開胸手術(shù)前，腹腔注射給予1mg·kg-1即1ml·kg-1（藥物濃度為 1 g·L-1）的 Met＋4 ml·kg-1NS，30 min后實(shí)施I/R程序；⑥ 三藥聯(lián)用組（NGM group，n＝16）：麻醉后開胸手術(shù)前，腹腔注射給予1 ml·kg-1Nic＋1 ml·kg-1Glu＋1 ml·kg-1Met＋2 ml·kg-1NS，30 min后實(shí)施I/R程序；⑦三藥聯(lián)用低劑量組（NGML group，n＝16）：麻醉后開胸手術(shù)前，按 NMG組劑量的1/2腹腔注射給藥，30 min后實(shí)施I/R程序。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血/再灌注損傷模型的建立 ♂Wistar大鼠用25%烏拉坦（1 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰位固定于手術(shù)臺(tái)。連接BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)體表心電圖。行頸總動(dòng)脈插管、氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。于胸骨左緣3 mm處縱向剪開胸部皮膚，鈍性分離肌肉，止血鉗于第4、5肋間開胸，剪開心包，暴露心臟。以左冠狀靜脈為標(biāo)志，從左心耳下緣1 mm處進(jìn)針，經(jīng)LAD下，于肺動(dòng)脈圓錐旁出針。收緊結(jié)扎線，阻斷LAD血流，造成心肌缺血；心肌缺血30 min后，松開結(jié)扎線，恢復(fù)血液灌注，進(jìn)行再灌注2 h程序。

1.2.2 藥物預(yù)處理（PP）模型的建立 大鼠麻醉后，腹腔注射給予相應(yīng)的藥物，觀察并記錄心電圖變化，30 min后行開胸手術(shù)，實(shí)施心肌缺血30 min，再灌注2 h程序。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 心臟LAD冠脈再灌注120 min時(shí)迅速取下心臟，取中下1/3部分于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。經(jīng)TUNEL染色，凋亡陽性心肌細(xì)胞核被染成棕黃色，非凋亡心肌細(xì)胞核為藍(lán)色。每只大鼠觀察2張切片，每張切片分別計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野（400×）中的凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)和總細(xì)胞核數(shù)，并各取平均值，凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)與總細(xì)胞核數(shù)的比值作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、HSP-70的表達(dá) 心臟LAD冠脈再灌注120 min時(shí)迅速取下心臟，垂直于心臟長(zhǎng)軸方向，取中上2/3左心室前壁心肌組織用于檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以ˉx±s表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。單因素方差分析總體上存在顯著性差異，方差齊時(shí)，組間比較采用LSD法；方差不齊時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)法。所有分析均使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 尼可地爾、美托洛爾、谷氨酰胺單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)大鼠I/R損傷后心肌細(xì)胞凋亡的影響 I/R組中有大量的凋亡細(xì)胞，單用及聯(lián)合用藥組中凋亡細(xì)胞則明顯減少。I/R組細(xì)胞凋亡率明顯高于Sham組，表明I/R損傷后細(xì)胞凋亡明顯；而NGM組細(xì)胞凋亡率明顯低于I/R組，表明聯(lián)合用藥可以抵抗I/R損傷引起的細(xì)胞凋亡；與藥物單用組相比，NGM組細(xì)胞凋亡率明顯降低，表明聯(lián)合用藥可以從多個(gè)方面抑制細(xì)胞凋亡。見Fig 1，2。

2.2 尼可地爾、美托洛爾、谷氨酰胺單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)大鼠I/R損傷后Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 I/R組與Sham組相比Bcl-2的表達(dá)較少，各藥物預(yù)處理組與I/R組相比Bcl-2的表達(dá)均明顯增加，但與藥物單用組相比，NGM組Bcl-2表達(dá)增加更多；I/R組較Sham組Bax表達(dá)明顯增加，藥物預(yù)處理組與I/R組相比Bax表達(dá)均明顯降低，與藥物單用組相比，NGM組和NGML組Bax表達(dá)更低（P＜0.01）；I/R組的Bcl-2/Bax值最小，約為Sham組的22%；藥物預(yù)處理組的Bcl-2/Bax值均有所增加，以NGM組增幅最大，且與單用藥物組以及NGML組的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見Fig 3～5。

Fig 1 Changes of apoptosis determ ined by TUNEL in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group（400×）A：Sham；B：I/R；C：Nic；D：Glu；E：Met；F：NGM：G：NGML.

Fig 3 Bcl-2 andβ-actin ofm yocardial cells by W estern blot

Fig 4 Bax andβ-actin ofmyocardial cells by Western blot

Fig 5 Changes of Bcl-2/Bax in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group**P＜0.01 vs sham；△△P＜0.01 vs I/R；＃＃P＜0.01 vs NGM

2.3 尼可地爾、美托洛爾、谷氨酰胺單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)大鼠I/R損傷后HSP 70表達(dá)的影響 與Sham組相比，I/R組HSP70的表達(dá)略有增加；與I/R組相比，各藥物單用組以及聯(lián)合用藥組HSP 70的表達(dá)均明顯增加，尤以NGM組增幅最大，約為I/R組的2.4倍。見Fig 6，7。

Fig 6 HSP 70 andβ-actin ofm yocardial cells by W estern blot

3 討論

細(xì)胞凋亡是1972年由Kerr教授根據(jù)形態(tài)學(xué)特征首先提出的，它是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡［6］。細(xì)胞凋亡有著非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，其中Bcl-2基因家族是目前研究較多的與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因，Bcl-2與Bax基因均屬于Bcl-2基因家族，但兩者的作用相反，Bcl-2為抑制細(xì)胞凋亡的基因，而Bax為促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因。研究結(jié)果表明，Bcl-2/Bax比值的大小可反映Bcl-2和Bax在細(xì)胞凋亡中的作用，若Bcl-2/Bax比值較高，則抑制細(xì)胞凋亡；反之，Bcl-2/Bax比值較低，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7-8］。本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率［9］；Western blot法檢測(cè)凋亡調(diào)節(jié)蛋白和心肌細(xì)胞HSP70的表達(dá)，評(píng)價(jià)I/R過程中聯(lián)合用藥預(yù)處理對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：I/R組缺血區(qū)的細(xì)胞凋亡率較高，采用藥物預(yù)處理可以降低細(xì)胞凋亡率；I/R組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Bcl-2/Bax值較低，采用藥物預(yù)處理組可以使Bcl-2/Bax值升高。由此結(jié)果我們可以看出，尼可地爾、谷氨酰胺、美托洛爾單獨(dú)及聯(lián)合用藥可以減少大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心肌細(xì)胞的凋亡。

MIRI過程中細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制［10］為：①凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，如Bcl-2家族、p53、Fas抗原等；②中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氧自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞因子的大量表達(dá)等。HSP70發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制［11-12］主要為：通過結(jié)合因缺血而受損的蛋白，修復(fù)并維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；維護(hù)心肌鈣離子的穩(wěn)定；保護(hù)心肌線粒體功能；調(diào)節(jié)敏感性鉀通道活性等。

尼可地爾［13］的抗心肌細(xì)胞凋亡作用與KATPC的開放有關(guān)，它是一種非選擇性的KATPC開放劑，可同時(shí)開放細(xì)胞膜和線粒體內(nèi)膜上的KATPC［14］。美托洛爾一方面通過抑制心肌細(xì)胞β受體，降低心肌收縮力，減慢心率，抑制交感神經(jīng)和中性粒細(xì)胞激活，減輕鈣超載，達(dá)到抗凋亡作用［15］；另一方面，美托洛爾能減少Fas、caspase-3、p53等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。氧自由基是心肌缺血/再灌注損傷的重要因素之一，谷氨酰胺一方面能夠通過誘導(dǎo)谷胱甘肽的合成保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，另一方面也能夠提供谷胱甘肽的前體從而增加心肌組織氧自由基的清除，有利于心肌缺血/再灌注后心肌細(xì)胞的恢復(fù)；許多研究表明，谷氨酰胺還可以增加HSP的表達(dá)，達(dá)到對(duì)抗應(yīng)激刺激起到保護(hù)細(xì)胞的［16］。HSP70對(duì)細(xì)胞凋亡的死亡受體通路和線粒體通路均有抑制作用［17］。

綜上所述，聯(lián)合用藥通過增加氧自由基的清除，減輕心肌細(xì)胞鈣超載，保護(hù)線粒體，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌缺血預(yù)適應(yīng)，增加保護(hù)性蛋白HSP70的表達(dá)等途徑作用在心肌缺血/再灌注損傷的各個(gè)環(huán)節(jié)；從缺血預(yù)適應(yīng)、心肌細(xì)胞能量代謝和抑制細(xì)胞凋亡三個(gè)層面，達(dá)到協(xié)同抗凋亡作用。

Fig 7 Changes of HSP protein expresion determ ined by Western blot in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group（%ofβ-actin）**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R；＃＃P＜0.01 vs NGM

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