PRB介導子宮內膜癌細胞對MPA敏感性的作用機制研究

王 晶，孫 笑，王麗華，王玉東

（上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院婦科，上海 200030）

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是最常見的婦科惡性腫瘤之一，年輕的內膜癌患者也相對增加。5%～14%的內膜癌患者發病年齡小于40歲，多有肥胖、不育、多囊卵巢綜合征及月經不調，保留生育 /內分泌功能成為年輕患者的強烈要求。目前，孕激素長期、大量應用為年輕子宮內膜癌患者保守治療及晚期、復發患者的主要方法。孕激素對子宮內膜不典型增生、低級別子宮內膜癌的反應率分別為67%～82%、50%～70%，仍有一部分分化良好的年輕早期患者激素治療無效，出現復發和轉移，最終采取手術切除子宮。孕激素主要是通過孕激素受體B（progesterone receptor B，PRB）抑制腫瘤的生長。本研究在分析PRB介導內膜癌細胞對孕激素敏感性的基礎上，進一步探討PRB下調后，MPA對內膜癌細胞生物學行為的影響及相關機制，為正確選擇內膜癌的治療方法，提高療效提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人子宮內膜癌細胞系Ishikawa購自美國模式菌種收集中心 （ATCC）。細胞培養基DMEM-F12、胎牛血清 （FBS）購自美國Gibco公司。MTT、MPA為Sigma公司產品，DMSO購自Amresco公司。MPA以DMSO溶解為濃度10 mol·L-1的儲存液，充分溶解后分裝，-20℃保存，培養液中DMSO的終濃度不超過0.1%。兔抗人ERK、p-ERK多克隆抗體為CST公司產品，TRIzol為Invitrogen公司產品，逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒為TaKaRa公司產品，引物由上海生工公司合成，蛋白Marker為 Thermo公司產品，慢病毒包裝系統由pENTR/U6-shRNA載體、PL/IERES/GFP/U6載體、pIRES2-EGFP-prb載體組成，購自上海諾百生物科技有限公司，Matrigel膠購自BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養基中，37℃、5%CO2常規培養，每1～2天換液1次。

1.2.2 慢病毒載體的制備 選擇GenBank中人PRB基因編碼區序列（NM000926.4）作為分析序列，設計、合成4對針對PRB基因shRNA的寡核苷酸序列。據其對PRB基因的抑制率，確定最佳干擾序列為：5′-CACCGCATGATCTTGTCAAACAACTCGA AAGTTGTTTGACAAGATCATGC-3′。構成表達 shRNA的重組慢病毒質粒載體，并行酶切鑒定。

1.2.3 慢病毒包裝及滴度測定 PRB shRNA的重組慢病毒質粒載體及兩種輔助載體共轉染293T細胞，培養48 h后，收集細胞培養上清，濃縮后得到高滴度慢病毒濃縮液，采用10倍系列孔稀釋后，轉染293T細胞。

1.2.4 細胞分組及感染 細胞分為干擾組IskshRNA-PRB、陰性對照組 Isk-shRNA-NC、空白對照組Isk，將細胞懸液接種于96孔板，常規培養，細胞覆蓋80%左右時，根據MOI值，進行病毒侵染實驗，收集感染成功率80%以上的細胞，抽提RNA及蛋白分別進行qPCR及Western blot，檢測靶點的干擾效率。

1.2.5 qPCR測定PRBmRNA 按照試劑盒操作步驟，抽提上述3組Ishikawa細胞總RNA，用紫外分光光度法測定RNA濃度。PCR反應條件：95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以上實驗重復3次。

1.2.6 MTT法檢測細胞增殖能力 每孔約8×103細胞接種至96孔板，每組設8個平行孔，干擾組分別加入不同濃度的 MPA（0.01、0.1、1、10μmol·L-1），以加等體積DMSO作為溶劑對照。酶標儀測490 nm處吸光度值，繪制生長曲線。實驗重復3次。

1.2.7 Transwell法測定侵襲能力 用 Matrigel 1∶6稀釋包被Transwell小室底部，小室外加500μl含10%胎牛血清培養液，小室內加入100μl不含血清細胞懸液，細胞密度為5×108·L-1，24 h后取出小室，經固定、染色，200倍鏡下取5個視野計數穿膜細胞數，取其平均數。

1.2.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞接種24 h后，換以無血清培養液培養18 h，加入10μmol·L-1MPA，以加相同體積的DMSO作為溶劑對照，終濃度不超過0.1%。于48 h收集細胞，重懸并加入Annexin V-7AAD、PE染料，混勻，避光。1 h內，應用流式細胞儀檢測。

1.2.9 Western blot檢測 SDS細胞裂解液裂解細胞，SDS-PAGE電泳分離蛋白，Bio-Rad微型電轉移系統將蛋白轉移至硝酸纖維膜上，封閉1 h，加兔抗人PRB多克隆抗體 （1∶500稀釋）、兔抗人ERK（1∶1 000稀釋）及p-ERK抗體 （1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，ECL發光，X線膠片顯影、定影并掃描記錄，以β-actin為內參，以上實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 15.0軟件進行統計，實驗數據采用ˉx±s表示，各組的組間均數比較用方差分析。

2 結果

2.1 慢病毒載體的制備、鑒定、滴度測定及感染PRB shRNA重組慢病毒載體質粒轉化DH5α大腸桿菌，細菌陽性克隆經PCR擴增，PCR產物1 954 bp。測序結果表明，插入的片段與設計的PRB shRNA序列一致，沒有突變、缺失、插入等異常存在。以293T細胞GFP蛋白的表達水平為對照，經逐孔稀釋滴度法測定慢病毒濃縮液滴度為2×105Tu·L-1，說明有大量質粒轉入293T細胞，病毒包裝成功。

2.2 慢病毒感染對Ishikawa細胞PRB表達水平的干擾效率鑒定 qPCR結果顯示，Isk-shRNA-PRB組細胞中PRB mRNA的表達量僅為Isk-shRNA-NC組細胞的39.5%，即抑制率為60.5%，而陰性對照組與空白對照組細胞的PRB mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與陰性對照組相比，干擾組Ishikawa細胞PRB的mRNA水平明顯降低 （P＜0.05）。Western blot結果顯示，干擾組細胞中PRB蛋白的表達量僅為陰性對照組的38.7%，即抑制率為61.3%，而陰性對照組與空白對照組細胞的PRB蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。說明與陰性對照組相比，干擾組Ishikawa細胞PRB的蛋白水平下降 （P＜0.05）。

2.3 干擾PRB表達，促進Ishikawa細胞增殖、侵襲，抑制凋亡 MPA可抑制空白對照組和陰性對照組Ishikawa細胞的增殖活性，1、10μmol· L-1的MPA抑制率分別為17.6%、43.8%，與干擾組相比差異均有統計學意義 （P＜0.01），見 Fig 1A。而MPA對Isk-shRNA-PRB組細胞無抑制增殖的作用，高濃度MPA（10μmol· L-1）作用d 3反而促進細胞增殖，促增殖率為17.9% （與空白對照組和陰性對照組相比均有P＜0.01），見Fig 1B。

侵襲實驗結果顯示，Isk-shRNA-PRB組細胞穿過人工基底膜的平均數為101，明顯多于陰性對照組（53）和空白對照組（48），差異具有統計學意義（P＜0.01），見 Fig 2。

MPA可誘導對孕激素敏感的Ishikawa細胞凋亡，MPA作用48 h，凋亡比例與干擾組比較差異具有統計學意義 （P＜0.01），見Fig 3。

2.4 慢病毒感染Ishikawa細胞后PRB蛋白的表達情況及MAPK通路的激活 MPA作用24 h，檢測ERK磷酸化情況，結果顯示：MPA激活干擾組細胞p-ERK相關的MAPK/ERK信號通路，而空白對照組和陰性對照組ERK磷酸化較弱或無，見Fig 4。

Fig 1 Effects of MPA on proliferative activity and growing abilityA：Effects of different concentrations of MPA on the proliferation of the Isk，Isk-shRNA-NC and Isk-shRNA-PRB cells；B：Effects of MPA（10μmol· L-1）on the growing ability of Isk，Isk-shRNA-NC and IskshRNA-PRB cells.**P＜0.01 vs Isk or Isk-shRNA-NC

Fig 2 Effects of MPA on capacity of invasionRepresentative imagesof Transwell invasion assay using10%FBSas chemoattractant showed thatafter treatmentwith MPA（10μmol· L-1）for 24 h，Isk-shRNA-PRB cells increased the capacity of invasion.Statistical data are shown below the figures.**P＜0.01 vs Isk or Isk-shRNANC

Fig 3 Effects of MPA on cell apoptosisThe effectson cellapoptosisof Isk，Isk-shRNA-NC and Isk-shRNA-PRB cells，after treatmentwith MPA（10μmol· L-1）for48 h.Statistical data are shown.**P＜0.01 vs Isk or Isk-shRNA-NC

3 討論

目前，肥胖和多囊卵巢綜合征越發流行，絕經前女性內膜癌發病率逐年上升，孕激素對該病的防治尤為重要［1］。超過30% 分化良好的Ⅰ型子宮內膜癌患者對孕激素治療無反應［2］，其潛在的機制不甚了解。

孕激素受體（PR）是細胞內受體，屬于甾體激素受體超家族的一種結構復雜的蛋白質，其調控眾多目標基因的轉錄［3］。PR具有兩種亞型，即PRA和PRB，它們是同一基因經不同啟動子轉錄而來。與PRB相比，PRA在氨基端缺少164個氨基酸，因而PRA和PRB具有不同的活性和功能。研究表明：表觀遺傳機制如DNA甲基化和組蛋白修飾對調控PRA和PRB總蛋白的表達至關重要［4］。子宮內膜癌細胞從孕激素敏感到耐藥存在一種假說：由于編碼PRB的DNA發生甲基化，導致PRB表達下降，抑制黏附分子和細胞周期調控蛋白的表達，并促進凋亡抑制蛋白BIRC3的表達，從而促進轉移、增殖，抗凋亡。另一項研究表明，子宮內膜癌細胞PRB表達下降很可能是孕激素治療失敗的癥結［5］。也有研究提示，PTEN基因與子宮內膜癌細胞耐藥密切相關［6］。

大劑量孕激素對分化良好、雌激素受體 （ER）和PR陽性的內膜癌患者反應率高［7］。對于子宮內膜癌細胞，表達內源性或重組PR，孕激素治療可抑制細胞生長、浸潤，同時促進分泌表型的分化和誘導復制性衰老［8］。維持PR表達水平，尤其PRB水平對孕激素的抗腫瘤作用至關重要。有研究表明，孕激素對細胞生長和浸潤的抑制作用主要通過PRB的激活［9］。PRB表達水平降低的子宮內膜癌患者通常預后不佳，可能由于MPA耐藥所致［9］。本實驗將ER、PR陽性，對孕激素抑制作用敏感的人子宮內膜癌Ishikawa細胞進行慢病毒載體構建，干擾PRB表達，結果表明，內膜癌細胞PRB表達下調，對MPA生長抑制作用耐受。

孕激素能夠影響耐藥細胞的生物學行為。有研究表明，MPA可通過下調CyclinD1、MMP2、MMP9基因的表達，抑制內膜癌細胞增殖及侵襲能力［10］。在孕激素核受體缺失時，孕激素起到有絲分裂原作用，促進腫瘤細胞增殖［11］。本實驗結果表明，干擾PRB表達，孕激素促進子宮內膜癌細胞增殖、侵襲，抗凋亡。孕激素對PRB下調后，癌細胞生物學行為影響的作用機制尚無明確認識。一般認為，孕激素通過與其特異性靶細胞結合后刺激分化，可使內膜發生分泌期改變，促使內膜癌細胞分化趨向成熟，細胞發生凋亡和萎縮，抑制腫瘤生長［7］。有研究認為，孕激素可直接作用癌細胞，延緩DNA、RNA的復制，抑制癌細胞生長。還有研究提出，孕激素經PRB介導促進黏附分子表達，如整合素、纖維結合素、鈣黏蛋白6，抑制內膜癌細胞遷移、浸潤［9］。MAPK通路是將促有絲分裂信號傳遞到核內，引起細胞增殖分化的主要信號轉導系統。激活的ERK1/2與細胞增殖、分化密切相關。pERK1/2進入胞核內，促使cjun、c-fos、c-myc等原癌基因的表達，細胞由G1期進入S期，促進癌細胞惡性增殖。另外，ERK可調節cyclinE，同時滅活細胞周期抑制蛋白P27KIP的表達，從多個水平調控細胞周期。研究報道，ERK可使一些分子發生磷酸化，如轉錄因子ELK-1、CCAAT增強結合蛋白β、cAMP反應元件結合蛋白，促使Bcl-2抗凋亡因子表達增加［12］。另有研究發現，pERK1/2活性增高與基質金屬蛋白酶類的分泌及α6整合素的高表達密切相關，表明ERK1/2可通過蛋白分解調控癌細胞的惡性行為［13］。本研究提示，MPA使PRB下調的子宮內膜癌細胞發生明顯的ERK磷酸化，對敏感細胞則ERK磷酸化較弱或無。說明孕激素對PRB下調的Ishikawa細胞存在不通過與PR結合的途徑，而是有其他路徑激活ERK/MAPK信號通路，促進增殖、侵襲。

綜上所述，PRB表達情況與保守治療的成功率密切相關。研究孕激素作用機制，為解決年輕早期子宮內膜癌患者的生育要求具有一定的臨床意義。

Fig 4 Effects of MPA on phosphorylation of ERK geneDetection of the phosphorylation of ERK gene in Isk，Isk-shRNA-NC and Isk-shRNA-PRB cells，after treatmentwith MPA（10μmol· L-1）for 24 h.

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