背側(cè)海馬CA1區(qū)5-HT2A受體超微分布以及對神經(jīng)元電活動影響

龐 剛，章功良

（安徽醫(yī)科大學(xué)1.人體解剖學(xué)教研室、2.生理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032）

腦內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，serotonin，5-HT）神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)可調(diào)節(jié)機(jī)體記憶和其它認(rèn)知行為反應(yīng)，以適應(yīng)內(nèi)、外環(huán)境的變化，5-HT2A受體可能是介導(dǎo)這些作用的靶點(diǎn)之一［1-2］。5-HT2A受體屬G蛋白偶聯(lián)膜受體家族，激活后可增強(qiáng)磷脂酶C的活性，提高細(xì)胞內(nèi) Ca2＋濃度［3］。大量研究表明，5-HT2A受體激活可促進(jìn)嚙齒類動物和人類的學(xué)習(xí)和記憶活動［4-8］。形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2A受體大量存在于調(diào)節(jié)認(rèn)知、特別是與記憶相關(guān)的中樞結(jié)構(gòu)，如海馬、杏仁體和大腦皮質(zhì)［2，9］。海馬含有多種類型的錐體細(xì)胞和中間神經(jīng)元，其接受腦干中縫核5-HT能神經(jīng)元的纖維投射［2，10］，5-HT可能是通過與海馬谷氨酸能神經(jīng)元和抑制性中間神經(jīng)元的相互作用而調(diào)節(jié)記憶［11-12］。在功能上，激活5-HT2A受體可增加谷氨酸釋放［12］、NMDA受體敏感度［13］和嚙齒類動物的條件操作性記憶［13］，而受體阻斷則可產(chǎn)生相反結(jié)果［14-16］，提示海馬5-HT2A受體和谷氨酸NMDA受體存在結(jié)構(gòu)和功能協(xié)同關(guān)系。然而，海馬5-HT2A受體的亞細(xì)胞定位及其與NMDA受體的空間關(guān)系尚不明確。為此，本研究采用包埋后免疫電鏡技術(shù)確定5-HT2A受體在大鼠背側(cè)海馬CA1（dCA1）區(qū)的亞細(xì)胞分布及與NMDA受體分布的關(guān)系。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2A受體激動劑TCB-2可增加海馬依賴性記憶［4］，但其中樞機(jī)制尚不明確。海馬可能是一個(gè)重要的靶點(diǎn)，為明確5-HT2A受體興奮后的海馬神經(jīng)元細(xì)胞電生理變化，我們采用多通道記錄方法觀測其對神經(jīng)元電活動的影響，以進(jìn)一步明確5-HT2A受體在海馬依賴性記憶中的作用機(jī)制，豐富海馬記憶理論，并為治療記憶障礙的新藥開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年SPF級動物（實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：34000200000043），♂。Sprague-Dawley大鼠（體質(zhì)量220～250 g）由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，C57BL小鼠（體質(zhì)量20～25 g）購自Jackson實(shí)驗(yàn)室。動物置于12/12 h明/暗環(huán)境中，環(huán)境溫度22℃～25℃，動物自由攝食水。動物使用嚴(yán)格遵循安徽醫(yī)科大學(xué)和安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心醫(yī)學(xué)科研動物使用守則。

1.1.2 藥物和試劑 水合氯醛（國藥集團(tuán)）；小鼠抗大鼠谷氨酸受體抗體（Merck Millipore，MAB397，美國）；生物素標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG（Calbiochem，401213，美國）；兔抗大鼠 5-HT2A受體抗體（Calbiochem，PC176，美國）；5 nm膠體金標(biāo)記山羊抗兔IgG（Sigma，G7277，美國）；進(jìn)口羊血清工作液、DAB（中杉金橋）；TCB-2（Torcis，2592，美國）。

1.1.3 儀器 JEM-1230透射電鏡（JEOL，日本）；旋鈕器（Instech，美國）；Plexon多通道采集處理系統(tǒng)（Plexon Inc，美國）；NeuroExplorer（3.266版本，Nex Technologies，MA，美國）；腦立體定位儀（淮北振華）。

1.2 方法

1.2.1 包埋后免疫電鏡技術(shù) SD大鼠10只，水合氯醛（70 g·L-1，350 mg·kg-1）腹腔內(nèi)注射麻醉后，剖開胸腔，經(jīng)左心室插管至升主動脈，PBS緩沖液快速沖洗，4%多聚甲醛灌注固定。完畢后，完整取出腦組織。參照Paxinos和Watson《大鼠腦立體定位圖譜》，從腦組織中剝離dCA1區(qū)，切成1 mm3大小，固定于2.5%戊二醛及1%鋨酸，環(huán)氧樹脂Epon-812包埋，超薄切片70 nm，載于200～300網(wǎng)孔鎳網(wǎng)上。置3%H2O2內(nèi)20min，雙蒸水沖洗3次；浮于正常羊血清（1∶50）30 min，PBS沖洗；孵育于小鼠抗大鼠谷氨酸受體抗體（1∶50），4℃過夜；PBS沖洗3次后，生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶100）30 min，PBS沖洗；DAB（1∶50）顯色10 min，PBS沖洗；將鎳網(wǎng)翻過來，浮于正常羊血清（1∶50）30 min，PBS沖洗；孵育于兔抗大鼠5-HT2A受體抗體（1∶50）5 h，PBS沖洗；5 nm膠體金標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶5）37℃ 30 min，PBS沖洗；醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。

1.2.2 在體自由運(yùn)動大鼠單細(xì)胞放電記錄和數(shù)據(jù)分析 C57BL小鼠20只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。通過腦立體定位手術(shù)植入16通道（4個(gè)四電極）可移動式微電極陣列，調(diào)節(jié)電極深度以記錄右側(cè)dCA1錐體細(xì)胞層的電活動。術(shù)后動物休息1周。實(shí)驗(yàn)組給予TCB-2（1.0 mg·kg-1）腹腔注射，對照組給予生理鹽水。采用Plexon多通道采集處理系統(tǒng)記錄神經(jīng)元放電（濾波150～8000 Hz，采樣頻率40 kHz）和場電位（濾波0.7～400 Hz，采樣頻率1 kHz），同步采用Plexon CinePlex圖像追蹤系統(tǒng)記錄小鼠行為學(xué)。Plexon SortClient軟件（2.6版本）記錄場電位、神經(jīng)元放電波形及其對應(yīng)的時(shí)間標(biāo)記，保存為 Plexon系統(tǒng)格式化文件（*.plx）。利用Plexon OfflineSorter軟件（3.2.1版本），采用手工和自動方法分析篩選神經(jīng)元放電信號，僅對清晰的、在1 ms不應(yīng)期內(nèi)放電比例＜0.5%的神經(jīng)元放電進(jìn)行分析。基于神經(jīng)元放電活動特性區(qū)分錐體細(xì)胞和中間神經(jīng)元。錐體細(xì)胞的放電特征有：①低平均放電頻率（0.5～10 Hz）和不規(guī)則放電模式；②峰電位間距直方圖顯示短峰電位間距（3～10 ms）占據(jù)優(yōu)勢，呈現(xiàn)特征性3～5 ms峰間距后指數(shù)性衰減；③寬波形（＞300μs）。而中間神經(jīng)元的放電特征為相對狹窄波形（＜250μs）、高平均放電頻率（＞5 Hz）和峰電位間距直方圖呈現(xiàn)延遲的尖峰和更為緩慢的衰減。采用NeuroExplorer（3.266版本）來分析神經(jīng)元放電波形及其特征。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS21.0軟件，應(yīng)用Student t檢驗(yàn)、Two-Way ANOVA和SNK多重檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠海馬dCA1區(qū)5-HT2A受體的配布電鏡下觀察到標(biāo)記5-HT2A受體的納米金顆粒電子密度高，呈顆粒狀，廣泛分布神經(jīng)元的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、軸突內(nèi)神經(jīng)絲，以及末端的突觸和突觸小泡內(nèi)，胞核和線粒體內(nèi)也有少量分布；谷氨酸NMDA受體免疫陽性產(chǎn)物呈絮狀，分布亦較廣泛，并在突觸小泡、神經(jīng)絲處與5-HT2A受體共區(qū)域表達(dá)（Fig 1）。

2.2 激活小鼠背側(cè)海馬CA1區(qū)5-HT2A受體對電活動的影響 腹腔給藥前，對照組主神經(jīng)元放電頻率為（0.55±0.16）Hz，實(shí)驗(yàn)組為（0.49±0.15）Hz。給藥后，對照組主神經(jīng)元放電頻率無明顯變化，為（0.59±0.20）Hz（t＝-0.398，P＞0.05，配對 t檢驗(yàn)）；而實(shí)驗(yàn)組則明顯升高，為（0.69±0.17）Hz（t＝-2.227，P＜0.05）。而中間神經(jīng)元放電頻率在給藥前，對照組為（8.37±1.92）Hz，實(shí)驗(yàn)組為（8.92±2.03）Hz；給藥后均無顯著性變化，對照組為（8.79±2.02）Hz（t＝-0.732，P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組為（7.81±1.73）Hz（t＝-1.873，P＞0.05）（Fig 2）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2A受體在海馬dCA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)分布廣泛，并在突觸、突觸小泡和神經(jīng)絲等處與NMDA受體共區(qū)域表達(dá)；激活dCA1區(qū)5-HT2A受體，可致主神經(jīng)元的放電頻率明顯升高，而對中間神經(jīng)元的放電頻率無明顯影響。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［4］，5-HT2A受體激活可促進(jìn)動物的學(xué)習(xí)和記憶活動，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)海馬可能是5-HT2A受體調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

Fig 1 Colocalization of serotonin 2A receptor with glutamate NMDA receptor in dorsal hippocampal CA1 areaA：Cell nucleus and cytoplasm（bar＝500 nm）；B：Neurofilament（bar＝200 nm）；C：Synapse（bar＝100 nm）；D：Synaptic vesicle（bar＝200 nm）.→：serotonin 2A receptor immunoreactivity；▲：glutamate receptor immunoreactivity；k：karyotheca；n：neurofilament；s：synapse；v：synaptic vesicle.

Fig 2 Activation of the serotonin 2A receptor increases principal neuronal firing rate in dorsal hippocam pal CA1 areaA：Brain atlas showing the location of recording as indicated by red circle.B：Top，time bin＝0.05s；middle，principalneuron firing pattern；bottom，interneuron firing pattern.C：Principle components，blue showing interneuron firing cluster and green showing principal neuron firing cluser.Grey ones are noise.D：Principal neuron（green）and interneuron（blue）firingwaveforms；grid 500μV，100μsec.E：Autocorrelograms of principal neuron（top）and interneuron（bottom）；bin＝5 ms.F：TCB-2 enhanced principal neuron firing rate.G：TCB-2 did not affect interneuron firing rate.*P＜0.05 vs pre-treatment.

學(xué)習(xí)和記憶是腦的重要高級功能之一，機(jī)體通過獲取新信息并加以儲存、利用以保證生存和進(jìn)化［4］。但隨著生理性老化或罹患神經(jīng)退行性疾病，腦均可出現(xiàn)不同程度的學(xué)習(xí)和記憶障礙。海馬是調(diào)控記憶和認(rèn)知的重要中樞之一，其實(shí)時(shí)接受、分析、修飾各種時(shí)間性和空間性環(huán)境信息，并將新、舊信息進(jìn)行整合、偶聯(lián)以更新現(xiàn)有認(rèn)識思維。海馬神經(jīng)元和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電活動介導(dǎo)空間性、非空間性的信息和事件的處理。海馬錐體細(xì)胞接受腦干中縫核5-HT能神經(jīng)纖維投射并表達(dá)5-HT2A受體［6］。dCA1區(qū)在海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶中占有重要地位［17］，光鏡下已證實(shí)海馬5-HT2A受體蛋白表達(dá)，但其在dCA1區(qū)的亞細(xì)胞定位仍不清楚。通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，5-HT2A受體與NMDA受體存在空間相鄰關(guān)系，提示這兩種受體可能相互影響，并可通過突觸前和突觸后機(jī)制調(diào)節(jié)記憶和其它海馬功能。理論上，不同的受體空間位置可有不同的調(diào)控機(jī)制。在突觸后膜谷氨酸NMDA受體通過調(diào)控長時(shí)程增強(qiáng)（LTP）和突觸可塑性促進(jìn)記憶的鞏固。激活突觸后膜上的5-HT2A受體可去極化膜電位和增加細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，從而易化NMDA受體，促進(jìn)記憶和其它海馬功能；激活突觸間隙外細(xì)胞膜的5-HT2A受體，可通過G蛋白機(jī)制調(diào)節(jié)膜電位和（或）細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶。

形態(tài)學(xué)已證實(shí)5-HT2A受體在dCA1區(qū)內(nèi)有廣泛表達(dá)，此受體可調(diào)節(jié)谷氨酸能神經(jīng)元活動和NMDA受體活性。興奮5-HT2A受體可增加dCA1區(qū)細(xì)胞外谷氨酸濃度，據(jù)此可以推測dCA1區(qū)5-HT2A受體通過改變海馬谷氨酸水平來調(diào)節(jié)海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶活動［18］。dCA1區(qū)錐體細(xì)胞是海馬記憶系統(tǒng)的基本組分，記錄其活動可評價(jià)海馬記憶進(jìn)程［19］。本研究通過腹腔注射TCB-2激活dCA1區(qū)5-HT2A受體，單神經(jīng)元細(xì)胞外放電記錄技術(shù)顯示主神經(jīng)元的放電頻率明顯升高，而中間神經(jīng)元的放電頻率無明顯變化，提示5-HT2A受體可通過改變海馬錐體細(xì)胞的機(jī)能活動而影響學(xué)習(xí)和記憶進(jìn)程。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)海馬dCA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)廣泛表達(dá)5-HT2A受體并存在與NMDA受體存在空間相關(guān)性，電生理和神經(jīng)化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，激活此區(qū)5-HT2A受體可致主神經(jīng)元放電頻率和谷氨酸濃度升高，這提示了5-HT2A受體可通過改變海馬錐體細(xì)胞的機(jī)能活動和谷氨酸水平來調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶活動。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Bekinschtein P，Renner M C，Gonzalez M C，Weisstaub N.Role of medial prefrontal cortex serotonin 2A receptors in the control of retrieval of recognition memory in rats［J］.J Neurosci，2013，33（40）：15716-25.

［2］ Jacobs B L，Azmitia EC.Structure and function of the brain serotonin system［J］.Physiol Rev，1992，72（1）：165-229.

［3］ Hoyer D，Clarke D E，F(xiàn)ozard JR，et al.International union of pharmacology classification of receptors for 5-hydroxytryptamine（serotonin）［J］.Pharmacol Rev，1994，46（2）：157-203.

［4］ Zhang G，ásgeirsdóttir H N，Cohen SJ，etal.Stimulation of serotonin 2A receptors facilitates consolidation and extinction of fear memory in C57BL/6Jmice［J］.Neuropharmacology，2013，64：403-13.

［5］ Wagner M，Schuhmacher A，Schwab S，etal.The His452Tyr variant of the gene encoding the5-HT2Areceptor is specifically associated with consolidation of episodic memory in humans［J］.Int J Neuropsychopharmacol，2008，11（8）：1163-7.

［6］ Khaliq S，Haider S，Ahmed SP，etal.Relationship ofbrain tryptophan and serotonin in improving cognitive performance in rats［J］.Pak JPharm Sci，2006，19（1）：11-5.

［7］ Levkovitz Y，Ophir-Shaham O，Bloch Y，etal.Effectof L-tryptophan on memory in patients with schizophrenia［J］.JNerv Ment Dis，2003，191（9）：568-73.

［8］ Porter R J，Lunn B S，O′Brien J T.Effects of acute tryptophan depletion on cognitive function in Alzheimer′s disease and in the healthy elderly［J］.Psychol Med，2003，33（1）：41-9.

［9］ Cornea-Hébert V，Riad M，Wu C，et al.Cellular and subcellular distribution of the serotonin 5-HT2Areceptor in the central nervous system of adult rat［J］.J Comp Neurol，1999，409（2）：187-209.

［10］Vertes R P.A PHA-L analysis of ascending projections of the dorsal raphe nucleus in the rat［J］.JComp Neurol，1991，313（4）：643-68.

［11］Boast C，Bartolomeo A C，Morris H，Moyer JA.5HT antagonists attenuate MK801-impaired radial arm maze performance in rats［J］.Neurobiol Learn Mem，1999，71（3）：259-71.

［12］Ciranna L.Serotonin as amodulator of glutamate-and GABA-mediated neurotransmission：implications in physiological functions and in pathology［J］.Curr Neuropharmacol，2006，4（2）：101-14.

［13］Arvanov V L，Liang X，Magro P，et al.A pre-and postsynaptic modulatory action of 5-HT and the 5-HT2A，2C receptor agonist DOB on NMDA-evoked responses in the ratmedial prefrontal cortex［J］.Eur JNeurosci，1999，11（8）：2917-34.

［14］Ceglia I，CarliM，Baviera M，etal.The5-HT receptor antagonist M100，907 prevents extracellular glutamate rising in response to NMDA receptor blockade in themPFC［J］.JNeurochem，2004，91（1）：189-99.

［15］Higgins G A，Enderlin M，Haman M，F(xiàn)letcher P J.The 5-HT2Areceptor antagonist M100，907 attenuates motor and‘impulsivetype’behaviours produced by NMDA receptor antagonism［J］.Psychopharmacology（Berl），2003，170（3）：309-19.

［16］Welsh SE，Romano A G，Harvey JA.Effects of serotonin 5-HT（2A/2C）antagonists on associative learning in the rabbit［J］.Psychopharmacology（Berl），1998，137（2）：157-63.

［17］Martin S J，Clark R E.The rodent hippocampus and spatialmemory：from synapses to systems［J］.Cell Mol Life Sci，2007，64（4）：401-31.

［18］MocciG，Jiménez-Sánchez L，Adell A，et al.Expression of 5-HT2Areceptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens.Potential relevance for atypical antipsychotic action［J］.Neuropharmacology，2014，79：49-58.

［19］DragoiG，Tonegawa S.Preplay of future place cell sequences by hippocampal cellular assemblies［J］.Nature， 2011， 469（7330）：397-401.