地塞米松及N-乙酰半胱氨酸抑制A549細胞IL-8及ICAM-1表達的機制研究

項 琪，付 欣，冉丕鑫，張 錦，鄭西衛，陳 娟，郭園園

（1.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004；2.廣州醫科大學，廣東 廣州 510182；3.寧夏醫科大學總醫院呼吸與危重癥醫學科，寧夏銀川 750004；4.大慶市第四醫院，黑龍江 大慶 163712）

慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種可以預防和治療的常見疾病，其特征是持續存在的氣流受限。氣流受限常呈進行性發展，伴有氣道和肺對有害顆粒或氣體所致慢性炎癥反應的增加［1］。慢性炎癥是慢阻肺發病的根本機制。糖皮質激素是臨床常用的治療多種炎癥性疾病的抗炎藥物，對于哮喘等呼吸系統疾病，糖皮質激素發揮重要抗炎作用，然而諸多的副作用限制了其在臨床中的應用，而且研究發現慢阻肺存在一定程度的激素抵抗。因此，研發新的抗炎藥物是慢阻肺防治中的重要內容。我們前期的研究表明：抗氧化劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC）具有良好的抗炎作用，可以抑制炎癥因子表達，但具體機制不明。糖皮質激素抗炎作用的發揮主要是通過乙酰化信號機制，作用于組蛋白去乙酰化酶（HDAC），通過影響炎癥相關基因的轉錄來發揮抗炎作用［2-3］，本課題通過對比研究 DXM與NAC對人肺泡上皮細胞A549細胞炎癥因子IL-8及ICAM-1炎癥基因的表達及炎癥相關轉錄因子的表達的影響，探討DXM及NAC抗炎作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞A549（美國菌種保存中心，批號：CCL-185），人IL-8試劑盒購自北京達科為公司。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購自美國Bisource公司，脂多糖（lipopolysaccharide）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和地塞米松21-磷酸二鈉（DXM）購自美國Sigma公司，胞質、胞核蛋白提取試劑盒購自北京賽諾博公司，BCA法蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司，HDAC活性檢測試劑盒購自北京達科為公司，激素受體（GR）抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，組蛋白去乙酰化酶1，2（HDAC1，2）抗體購自美國 Sant Cruz公司，轉錄因子核因子-κB（NF-κB）磷酸化抗體及活化蛋白-1（AP-1）抗體購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞用含100 ml·L-1胎牛血清（FBS）的DMEM（購自Gibco公司）培養基，在37℃、50 m l·L-1CO2細胞培養箱培養，3 d換液1次。

1.2.2 實驗分組 未處理組、TNF-α干預組、LPS干預組、DXM干預組、NAC干預組、TSA干預組、TNF-α和DXM共同干預組、TNF-α和NAC共同干預組、LPS和DXM共同干預組、LPS和NAC共同干預組。

1.2.3 各項指標檢測

1.2.3.1 ELISA法檢測 IL-8，流式細胞術檢測ICAM-1 根據實驗分組分別加入終濃度為10μg·L-1的TNF-α作用4 h；或分別加入終濃度為10-6mol·L-1的 DXM和30 mmol·L-1的 NAC預孵育30 min，再加入終濃度為10μg·L-1的TNF-α作用4 h。

1.2.3.2 蛋白印跡法檢測GR的表達 根據實驗分組分別加入終濃度為10μg·L-1的TNF-α、10mg·L-1的LPS作用4 h；或分別加入終濃度為10-6mol·L-1的 DXM和30 mmol·L-1的 NAC預孵育30 min，再加入終濃度為 10μg·L-1的 TNF-α、10 mg·L-1的LPS作用4 h。

1.2.3.3 蛋白印跡法檢測HDAC1、HDAC2的表達根據實驗分組，分別加入終濃度為10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的 DXM、10μg·L-1的 TSA；或者根據實驗分組，分別加入終濃度為10μg·L-1的TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用 4 h；或分別加入終濃度為 10-6mol·L-1DXM和 30 mmol·L-1的NAC預孵育30 min后再加入終濃度為10μg·L-1的 TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用 4 h。

1.2.3.4 蛋白印跡法檢測C-jun及NF-κB的表達根據實驗分組，分別加入終濃度為10μg·L-1的TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用 4 h；或分別加入終濃度為 10-6mol·L-1DXM和 30 mmol·L-1的NAC預孵育30 min后再加入終濃度為10μg·L-1的 TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用 4 h。

1.2.3.5 分光光度法檢測HDAC活性 根據實驗分組，分別加入終濃度為10μg·L-1的 TNF-α、10 μg·L-1的TSA作用24 h；或分別加入終濃度為10-6mol·L-1DXM和30 mmol·L-1的 NAC預孵育30 min后再加入終濃度為10μg·L-1的TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用24 h。

1.3 統計學分析 采用SPSS11.0軟件對數據進行分析，數據用ˉx±s表示，多個樣本均數之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗進行分析。

2 結果

2.1 DXM、NAC對A549細胞IL-8、ICAM-1表達的影響 在10μg·L-1的TNF-α作用前、后，A549細胞IL-8蛋白濃度分別為（1.67±0.07）ng·L-1和（3 576.04±3.02）ng·L-1，兩組相比差異有統計學意義（t＝-1931.83，P＜0.05）。與 TNF-α單獨作用相比，DXM、NAC預作用細胞可明顯降低TNF-α誘導下IL-8的高表達，差異有統計學意義（tDXM＝1893.46，P＜0.05；tNAC＝1894.8，P＜0.05）（Tab 1）。在 10μg·L-1的 TNF-α作用前后細胞ICAM-1蛋白濃度（熒光強度）分別為0.59±0.09和29.72±3.32，兩組相比差異有統計學意義（t＝15.17，P＜0.05）。與 TNF-α單獨作用相比，DXM、NAC預作用細胞可明顯降低TNF-α誘導的ICAM-1的表達，差異有統計學意義（tDXM＝4.27，P＜0.05；tNAC＝6.14，P＜0.05），見 Tab 2。

Tab 1 Effect of A549 cells on IL-8 expression induced by TNF-α and abolished by NAC and DXM in A549 cells（±s，ng·L-1）

Tab 1 Effect of A549 cells on IL-8 expression induced by TNF-α and abolished by NAC and DXM in A549 cells（±s，ng·L-1）

**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs TNF-αtreatment

Group IL-8t P Control 1.67±0.07 TNF-α 3576.04±3.20** -1931.83 ＜0.05 DXM 1.20±0.06** 8.261 ＞0.05 NAC 1.23±0.06** 7.91 ＞0.05 DXM＋TNF-α 19.44±0.50＃＃ 1893.46 ＜0.05 NAC＋TNF-α 26.41±0.51＃＃1894.8＜0.05

Tab 2 Effect of A549 cells on ICAM-1 expression induced by TNF-αand abolished by NAC and DXM in A549 cells（±s）（fluorescence intensity）

Tab 2 Effect of A549 cells on ICAM-1 expression induced by TNF-αand abolished by NAC and DXM in A549 cells（±s）（fluorescence intensity）

**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs TNF-αtreatment

Group ICAM-1t P Control 0.59±0.09 TNF-α 29.72±3.32** 15.17 ＜0.05 DXM 0.11±0.01** 0.10 ＞0.05 NAC 0.49±0.08** 1.00 ＞0.05 DXM＋TNF-α 18.58±3.07＃＃ 4.27 ＜0.05 NAC＋TNF-α 15.18±2.42＃＃6.14 ＜0.05

2.2 DXM、NAC對A549細胞GR表達的影響在TNF-α、LPS作用后，胞質內GR表達增強，加入DXM干預后激素受體胞質的表達降低而胞核的表達卻增強；NAC作用后，GR的胞質和胞核的表達沒有變化。見Fig 1、2。

Fig 1 Western blot test effect of A549 cells on GR expression induced by TNF-α，LPS and abolished by DXM in A549 cellsL：LPS；T：TNF-α；D：DXM

2.3 不同濃度 DXM對 A549細胞 HDAC1、HDAC2蛋白表達的影響 隨著DXM濃度的增大（10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的 DXM），HDAC1、HDAC2表達均有不同程度的增強，以10-6mol·L-1的DXM刺激后HDAC1、HDAC2表達最強，TSA能明顯降低HDAC的表達，見Fig 3。

Fig 2 W estern blot test effect of A549 cells on GR expressioninduced by TNF-α，LPS and abolished by NAC in A549 cells L：LPS；T：TNF-α；N：NAC

Fig 3 W estern blot test effect of A549 cells on HDAC1，HDAC2 expression abolished by different concentrations of DXM in A549 cells10-5：10-5 mol·L-1 concentration of DXM；10-6：10-6mol·L-1 concentration of DXM；10-7：10-7 mol· L-1 concentration of DXM；10-8：10-8mol·L-1 concentration of DXM

2.4 DXM、NAC對 A549細胞 HDAC1、HDAC2蛋白表達的影響 在TNF-α、LPS作用后HDAC表達降低，而用DXM干預后HDAC表達增強；NAC對HDAC的表達卻沒有影響，見Fig 4。

2.5 DXM、NAC對A549細胞HDAC活性的影響A549細胞HDAC的活性在未處理組、TNF-α、LPS作用后分別為（19.1±6.14）mol·L-1、（15.19±2.33）mol·L-1和（17.01±6.38）mol·L-1，與未處理組相比TNF-α、LPS作用明顯降低細胞HDAC活性（tTNF-α＝0.84，P＜0.05；tLPS＝0.33，P＜0.05）。DXM及NAC作用后細胞HDAC活性分別為（20.05±0.12）mol·L-1和（21.70±6.14）mol·L-1，DXM明顯增加細胞 HDAC活性（t＝-0.22，P＜0.05），NAC對細胞HDAC活性無影響（t＝-0.42，P＞0.05）。TSA能明顯抑制HDAC活性（t＝1.08，P＜0.05），見 Tab 3。

Tab 3 Effect of A549 cells on activity of HDAC induced byTNF-α，LPS and abolished by NAC and DXM in A549 cells

2.6 DXM、NAC對A549細胞轉錄因子 NF-κB、AP-1活化的影響 在TNF-α、LPS作用后細胞核活化的NF-κB表達增強，而加入DXM、NAC預處理細胞后再加入TNF-α、LPS刺激細胞，細胞核活化的NF-κB表達明顯減弱，見 Fig 5。

Fig 5 W estern blot test effect of A549 cells on NF-KB expression induced by TNF-α，LPS and abolished by NAC and DXM in A549 cellsL：LPS；T：TNF-α；N：NAC；D：DXM

2.7 DXM、NAC對A549細胞轉錄因子NF-KB、AP-1活化的影響 A549細胞在TNF-α、LPS作用后轉錄因子AP-1的表達增強，而加入DXM預處理細胞后再加入TNF-α、LPS作用細胞，AP-1的表達減弱；NAC預處理細胞后再加入TNF-α、LPS刺激細胞，NAC預處理組與TNF-α、LPS單獨作用組轉錄因子AP-1的表達作用無明顯變化，見Fig 6。

Fig 6 W estern blot test effect of A549 cells on C-jun expression induced by TNF-α，LPS and abolished by NAC and DXM in A549 cellsL：LPS；T：TNF-α；N：NAC；D：DXM

3 討論

慢阻肺的主要病理特征是肺組織和氣道的慢性炎癥，賀蓓等［4］研究發現：IL-8存在于氣道炎癥的始終，起著引發、維持甚至加重氣道炎癥的重要作用。ICAM-1是體內重要的黏附分子［5］。當刺激因子如IL-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、脂多糖（LPS）等炎性介質激活血管內皮細胞，使其上調表達ICAM-1，可以增加內皮細胞對中性粒細胞的黏附作用，促進中性粒細胞在組織內的集聚和浸潤［6］。DXM是治療多種炎癥性疾病的常見藥物，大量體內外實驗表明DXM對多種炎癥相關的細胞因子、黏附分子、酶受體的表達有明顯拮抗作用［7］。我們的研究結果表明：TNF-α誘導 A549細胞炎癥因子 IL-8及ICAM-1的表達。而DXM能夠明顯抑制TNF-α誘導的 A549細胞炎癥因子 IL-8、ICAM-1的表達［8］。本文結果證明糖皮質激素具有良好的抗炎作用。

針對糖皮質激素抗炎作用機制的研究表明：激素易于通過細胞膜進入細胞，與胞質內的激素受體（GR）結合。隨之激素-受體復合易位進入細胞核，進而對炎癥細胞和分子產生影響而發揮抗炎作用［9］。我們的結果顯示：DXM作用于A549細胞后，與位于細胞質的激素受體結合，導致GR入核增加，提示糖皮質激素通過與GR結合入核后發揮抗炎作用。

真核生物DNA表達有賴于轉錄激活，與組蛋白乙酰化酶（Histoneacetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDAC）的活性緊密相關。HAT使核小體中組蛋白-DNA的結合變得松散，利于RNA聚合酶的結合，促進炎癥因子如IL-8、ICAM-1等的轉錄和合成，促進炎癥反應的發生，而HDAC的作用正相反，抑制炎癥因子的轉錄和合成，抑制炎癥反應［10-11］。研究表明［2-3］：糖皮質激素與GR結合轉移至細胞核，募集HDAC形成復合體，促進組蛋白去乙酰化，抑制相關基因轉錄。我們的研究數據表明：10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的DXM分別作用于A549細胞后，其HDAC1、HDAC2蛋白表達均有不同程度的增強，HDAC抑制劑TSA能明顯降低HDAC的表達；針對HDAC活性的測定結果顯示：致炎因素TNF-α下調細胞HDAC的活性，而DXM作用于細胞后能明顯增加HDAC的活性，而且DXM預處理細胞能明顯拮抗TNF-α下調細胞HDAC活性的作用，此結果與免疫印跡的結果一致，提示DXM通過增加HDAC的活性及蛋白表達形成抗炎復合體，進入細胞核后通過促進組蛋白去乙酰化酶的作用，抑制相關基因的轉錄。

轉錄因子AP-1和NF-κB是涉及炎癥基因轉錄的重要轉錄因子，有研究表明［12］：糖皮質激素與GR結合后入核募集HDAC，從而抑制轉錄因子的轉錄活化，抑制炎癥相關基因的表達。GCs一方面通過其受體直接與 RelA（NF-κB異源二聚體的 p65亞基）相互作用，抑制NF-κB與DNA結合，阻斷其調控作用；另一方面是增加 NF-κB抑制蛋白 IκB基因的轉錄，抑制 NF-κB活性，從而發揮抗炎作用［13-14］。我們的研究結果顯示：致炎因素 TNF-α、LPS明顯上調A549細胞轉錄因子AP-1和NF-κB的轉錄活性，DXM明顯抑制TNF-α、LPS誘導下的轉錄因子AP-1和NF-κB的轉錄活化作用。提示：DXM對轉錄因子的活化有明顯的抑制作用。

對于慢阻肺患者，DXM不能有效的緩解肺功能的下降速率，對慢阻肺慢性持續性的炎癥過程無明顯改善［15-16］。提示慢阻肺可能存在一定程度的激素抵抗［17］，且糖皮質激素副作用大，我們需要研發更多的有效控制慢阻肺慢性炎癥的藥物。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一種經典的化痰藥物。近年來隨著研究的深入，發現NAC不僅具有黏液溶解作用，而且具有較強的抗氧化作用和促進表面活性物質生成等作用，NAC作為GSH的前體，是一種含有巰基的化合物，且含有促進還原型GSH生物合成的半胱氨酸，具有清除氧自由基、調節細胞的代謝活動，預防DNA損傷、調整基因的表達和信號轉導系統、抗細胞凋亡、抗血管生成、抑制惡性腫瘤發展等作用［18］。Blasi等［19］研究發現抗氧化劑 NAC能減少慢阻肺患者的發病次數、病情的惡化程度和發病的天數、減緩肺功能的下降速度。Su等［20］研究也發現NAC能減少細菌在支氣管的繁殖及減緩病程的進展，改善患者的肺功能、臨床癥狀和生活質量。本研究結果還顯示：NAC具有良好的抗炎作用，其能抑制致炎因素TNF-α誘導IL-8、ICAM-1的表達。我們研究結果還顯示：NAC對 A549細胞 HDAC1、HDAC2的蛋白表達無影響，對HDAC細胞活性無影響。同時，NAC對糖皮質激素受體入核過程亦無影響。但是，研究結果顯示：NAC有明顯抑制轉錄因子NF-κB轉錄活化的作用，但對于轉錄因子AP-1的轉錄活化沒有影響。因此，我們的研究結果表明：NAC與糖皮質激素的抗炎機制完全不同，NAC并沒有通過影響乙酰/去乙酰化信號機制抑制炎癥因子的表達，我們推測NAC的抗炎作用與其影響氧化/抗氧化平衡有關，并可能通過此路徑來發揮抗炎作用。

參考文獻：

［1］ 中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）［S］.中華結核和呼吸雜志，2013，36（4）：255-64.

［1］ The Chinesemedical association respiratory neurology，chronic obstructive pulmonary disease committee.Chronic obstructive pulmonary disease diagnosis and treatment guidelines（revised in 2013）［S］.Chin Tubercul Respira J，2013，36（4）：255-64.

［2］ Lauffer B E，Mintzer R，Fonq R，et al.Histone deacetylase（HDAC）inhibitor kinetic rate constants correlate with cellular histone acetylation butnot transcription and cell viability［J］.JBiolog Chem，2013，288（37）：26926-43.

［3］ 沈何清.環境化學壓力為表觀基因修飾：在毒理效應評估的新局面［J］.科學通報，2014，59（4）：349-55.

［3］ Shen H Q.Environmental chemical stressors as epigenomemodifiers：a new horizon in assessment of toxicological effects［J］.Chin Sci Bull，2014，59（4）：349-55.

［4］ 賀 蓓，趙鳴芳，王玉柱，等.慢性阻塞性肺疾病患者炎癥細胞因子與肺通氣功能的相關研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2003，26（1）：22-5.

［4］ He B，Zhao M F，Wang Y Z，et al.Inflammatory cytokines of patients with chronic obstructive pulmonary disease and pulmonary ventilation function of related research［J］.Chin Tub Resp J，2003，26（1）：22-5.

［5］ Traub S，Nikonova A，Carruthers A，et al.An anti-human ICAM-1 antibody inhibits rhinovirus-induced exacerbations of lung inflammation［J］.PLoSPathogens，2013，9（8）：e1003520

［6］ Stroka K M，Levitan I，Aranda-Espinoza H.OxLDL and substrate stiffness promote neutrophil transmigration by enhanced endothelial cell contractility and ICAM-1［J］.JBiomech，2012，45（10）：1828-34.

［7］ Besedovsky L，Born J，Lange T.Endogenous glucocorticoid receptor signaling drives rhythmic changes in human T-cell subset numbers and the expression of the chemokine receptor CXCR4［J］.FASEB J，2014，28（1）：67-75.

［8］ 郭圓圓，陳 娟.糖皮質激素及N-乙酰半胱氨酸對腺病毒E1A蛋白上調 IL-8、ICAM-1的抑制作用［J］.中國藥理學通報，2012，28（2）：235-9.

［8］ Guo Y Y，Chen J.Corticosteroids and n-acetyl cysteine for adenovirus E1A protein increases the inhibitory effect of IL-8，ICAM-1［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（2）：235-9.

［9］ Maslanka T.Dexamethasone inhibits and meloxicam promotes proliferation of bovine NK cells［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2013，35（2）：225-34.

［10］Zhou L，Ruvolo V R，McQueen T.HDAC inhibition by SNDX-275（Entinostat）restores expression of silenced leukemia-associated transcription factors Nur77 and Nor1 and of key pro-apoptotic proteins in AML［J］.Leukemia，2013，27（6）：1358-68.

［11］Wang X，Song Y，Jennifer J L，Tuan R S.Inhibition of histone deacetylases antagonized FGF2 and IL-1βeffects on MMP expression in human articular chondrocytes［J］.Growth Factors，2009，27（1）：40-9.

［12］Sundar IK，Yao H，Rahman I.Oxidative stress and chromatin remodeling in chronic obstructive pulmonary disease and smoking-related diseases［J］.Antioxid Redox Signal，2013，18（15）：1956-71.

［13］Espallergues J，Teegarden SL，Veerakumar A，et al.HDAC6 regulates glucocorticoid receptor signaling in serotonin pathways with critical impact on stress resilience［J］.JNeurosci，2012，32（13）：4400-16.

［14］黃 樾.內源性腎上腺糖皮質激素對血管炎癥反應抑制作用的研究［D］.廣州醫學院，2009.

［14］Huang Y.The inhibitory effects of endogenous glucocorticoid on vascular inflammation［D］.Guangzhou med coll，2009.

［15］Lee C，KlaustermeyerW B.Klaustermeyer.Effectof high dose inhaled corticosteroids on cell mediated immunity in patients with asthma［J］.Allergolog Immunopathol，2012，40（2）：100-3.

［16］Hoshino M，Ohtawa J.Effects of tiotropium and salmeterol/fluticasone propionate on airway wall thickness in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respiration，2013，86（4）：280-7.

［17］Marwick JA，Chung K F.Glucocorticoid insensitivity as a future target of therapy for chronic obstructive pulmonary disease［J］.Int JChron Obstruct Pulmon Dis，2010，5：297-309.

［18］Suresh S，Dharshan A，Dawn B.Pulmonary emboli in transit［J］.JGeneral IntMed，2013，28（1）：154.

［19］Blasi F，Schaberg T，Centanni S，et al.Prulifloxacin versus levofloxacin in the treatment of severe COPD patientswith acute exacerbations of chronic bronchitis［J］.Pulmon Pharmacol Therap，2013，26（5）：609-16.

［20］Su X M，Zhang JX，Guo Y L，et al.Study of effects of cigarette smoke condensates on acetylcholinesterase activity in human lung epithelial cells by matrix-assisted laser desorption/ionization-fourier transform mass spectrometry［J］.Analyt Lett，2012，45（18）：2687-96.