燈盞乙素衍生物代謝性質的快速體外評價

鄭 林，胡 杰，曹 旭，黃 勇，董永喜，王永林

（貴陽醫學院1.藥學院貴州省藥物制劑重點實驗室，2.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004）

燈盞乙素（scutellarin）主要來源于菊科飛蓬屬植物燈盞細辛（Erigeron breviscapus），是其主要活性成分。臨床上已應用燈盞乙素的各種劑型來治療心腦血管疾病?，F代研究發現，燈盞乙素口服后生物利用度極低，而體內真正的吸收與藥物發揮作用的形式是燈盞乙素苷元，但是燈盞乙素苷元仍存在代謝穩定性不佳的問題［1］。因此，本實驗室以燈盞乙素及其苷元為先導化合物，設計合成了11個衍生物，以期改善燈盞乙素的代謝穩定性。

據統計，在創新藥物研發過程中，約35%的候選化合物在臨床前研究階段因體內藥代動力學行為不良而停止開發。而進入臨床研究后，又有約40%的候選藥物因藥代動力學參數不佳而遭淘汰［2］。因此，在新藥開發的早期階段，利用體外模型對候選化合物藥動學特點進行初篩，以便在研究開發的早期確定該候選化合物是否有繼續開發的價值，還可根據篩選的結果對先導化合物進行結構改造或修飾，獲得具有良好藥動學特性的候選化合物［3］。同時，如果早期就能獲知化合物的代謝信息將有助于從藥理活性相似的化合物中選擇候選化合物。體外篩選實驗中，肝微粒體模型由于方便快捷、代謝條件易于控制、重現性好，成為候選化合物代謝穩定性篩選最常用的模型［4］。

目前，應用肝微粒體模型篩選化合物的代謝穩定性并檢測活性代謝產物的研究鮮有報道。因此，本實驗將通過肝微粒體模型篩選出代謝性質優于燈盞乙素及其苷元的候選化合物，對篩選出的化合物進行酶促動力學研究，并推測可能的代謝產物。

Tab 1 M ass spectrometric parameters

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 化合物Y1-Y6、W7-W11由貴陽醫學院藥學院提供；燈盞乙素苷元（批號201206，純度≥98%，上海順勃生物工程有限公司）；燈盞乙素（批號110842，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院）。NADP＋（購于Roche公司）；6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（均購于Sigma公司）；SD大鼠肝微粒體（廣州諾嘉生物科技有限公司）；其他試劑均為色譜純。

1.2 儀器 WATERS ACQUITY UPLC超高壓液相三重四級桿質譜聯用儀（二元梯度泵，真空脫氣機，柱溫箱，Masslynx 4.1質譜工作站，自動進樣器）；Allegra 64R低溫高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；AE240十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；CS501A超級恒溫水浴器（中國重慶銀河試驗儀器有限公司）。

1.3 色譜條件 色譜柱 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0→2.0 min，A∶B＝10∶90→90∶10；2.1→3.0 min，A∶B＝10∶90）；流速0.35 ml·min-1；柱溫 45℃；進樣量2μl。

1.4 質譜條件 采用電噴霧（ESI）離子源，在正離子電離模式下選用多反應監測（MRM）的質譜掃描方式進行測定，各參數見Tab 1。

其他具體質譜參數如下：毛細管電壓3 KV，離子源溫度120℃，去溶劑氣（氮氣）650 L·h-1，去溶劑氣溫度350℃，碰撞氣（氬氣）0.16 ml·min-1。

1.5 化合物的體外篩選

1.5.1 肝微粒體和化合物的孵育方法 終體積為200μl的體外孵育體系，包括大鼠肝微粒體蛋白0.5 g·L-1，6-磷酸葡萄糖 10 mmol·L-1，6-磷酸葡萄糖脫氫酶 0.5 kU·L-1，MgCl24 mmol·L-1，NADP＋0.5 mmol·L-1，以及所需量的化合物（篩選時，各化合物濃度均為2μmol·L-1），其余為PBS溶液。37℃預孵3 min，加入底物開始反應。每次加入反應體系中有機溶劑終濃度不超過1% （V／V）。每個樣品重復3次。反應完畢后加入一倍體積含1%甲酸的冰甲醇終止反應，-20℃放置30 min后，20 000×g離心10 min，上清液進樣分析［5］。

1.5.2 數據處理 采用一點法定量，以反應開始前的濃度為定量標準。消除速率常數ke為自然對數-濃度曲線上零時間和各時間點間直線的斜率，消除半衰期 T1/2＝0.693/ke。清除率 CLint（L·min-1·g-1）＝693/［T1/2（min）×蛋白濃 度 （g·L-1）］［7］。

1.6 W 11和燈盞乙素在大鼠肝微粒體中代謝的酶動力學 取凍存的大鼠肝微粒體，按照“1.5.1”的處理方法，使形成0.2 ml的溫孵體系。向0.5 g·L-1肝微粒體溫孵液中分別加入系列濃度的W11溶液（W11濃度分別為 0.83、1.65、3.29、6.60、13.21、19.80μmol·L-1）和燈盞乙素（燈盞乙素的濃度分別為 1.11、2.21、3.32、4.42、6.63、8.84、11.05、16.58μmol·L-1），6-磷酸葡萄糖 10 mmol·L-1，6-磷酸葡萄糖脫氫酶0.5 kU·L-1，NADP＋0.5 mmol·L-1，DMSO濃度不超過0.5%（V／V）。啟動反應后開始計時。溫孵100 min，預處理后，進行UPLCMS/MS分析，測定W11和燈盞乙素的剩余濃度。根據Lineweaver-Burk（雙倒數作圖法）來計算W11和燈盞乙素的酶促動力學參數Km，Vmax及CLint。

2 結果

2.1 待測化合物在SD大鼠肝微粒體中的消除待測化合物與SD大鼠肝微粒體孵育后其代謝穩定性結果見Tab 2。

2.2 化合物W 11與燈盞乙素的酶促動力學參數根據Lineweaver-Burk作圖法得到W11的米氏方程（Y＝436.73X＋97.54，r＝0.9982），其Vmax為（10.25±0.93）μmol·min-1·g-1，Km為（4.48±0.10）μmol·L-1，CLint為（2.29±0.23）L·min-1·g-1；燈盞乙素的米氏方程（Y＝223.04X＋21.92，r＝0.9957），其 Vmax為（45.95±9.50）μmol·min-1·g-1，Km為（10.19±1.66）μmol·L-1，CLint為（4.48±0.20）L·min-1·g-1。

2.3 W 11可能的代謝產物 在檢測W11原型的同時，也檢測了可能的代謝產物，燈盞乙素和M1。M1的質譜條件是母、子離子對的質荷比分別為：（＋）578.0→287.1，錐孔電壓30V，碰撞電壓30eV，其他條件同“1.4質譜條件”。

由于沒有標準品對M1進行定量分析，因此使用峰面積表示代謝產物生成情況。以W11的加入量為橫坐標，代謝產物（M1和燈盞乙素）的峰面積為縱坐標作圖（Fig 1），結果孵育100min時，隨W11的濃度升高，M1的生成量呈線性增加，其回歸方程為 Y＝249.40X ＋222.63（r＝0.9972）；燈盞乙素的生成量也呈線性增加，其回歸方程為Y＝53.21X＋73.76（r＝0.9873），并且在同一檢測條件下，其出峰時間和燈盞乙素標準品一致。由此推斷，W11在孵育體系中可能先脫甲基代謝生成M1，然后酯鍵水解釋放出活性代謝產物燈盞乙素（Fig 2）。

Tab 2 M etabolic elim ination and corresponding parameters of tested compounds in SD rat liver m icrosomes

3 討論

本研究應用肝微粒體模型篩選出代謝性質較燈盞乙素及其苷元有所改善的候選化合物W11。針對篩選的化合物W11，進行酶促動力學以及可能的代謝產物研究。結果表明，候選化合物W11可能具有優于燈盞乙素的代謝性質，并能釋放活性代謝產物燈盞乙素。

Fig 1 Peak area of M 1 and scutellarin

Fig 2 M etabolic pathways of W 11

該研究檢測結果中，由于化合物W11和M1的分子質量相差14，根據W11的結構特征，推測W11在孵育體系中可能先脫甲基代謝生成M1，然后酯鍵水解釋放出活性代謝產物燈盞乙素。該結論尚需通過高分辨質譜獲得M1的精確分子質量和二級質譜碎片離子信息，以此確認可能的分子結構。

藥動學的體內篩選和體外篩選是相輔相成的，藥動學的體內篩選可以對體外篩選的結果加以驗證；而體外篩選模型可以通過快速篩選對大量的候選化合物進行初篩，并對候選化合物的藥動學特性做出初步的評價，以縮小體內篩選的范圍［2］。本實驗采用體外肝微粒體轉運法快速初篩出代謝性質較佳，又可釋放活性代謝產物的W11，縮小體內篩選的范圍。但體外實驗難以完全模擬藥物在動物體內的藥動學行為，因此尚需通過體內藥動學實驗加以驗證，以期解決燈盞乙素和燈盞乙素苷元代謝穩定性不佳的問題，為新藥開發奠定基礎。

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