松果菊苷對阿爾采末病模型大鼠學習、記憶功能及氧自由基水平的影響

丁 慧，陳 虹，姜 勇，屠鵬飛，馬婧怡，張萬鑫

（1.石河子大學藥學院，教育部新疆特種植物藥資源重點實驗室，新疆石河子 832002；2.北京大學中醫藥現代研究中心，北京 100083）

松果菊苷 （echinacoside，ECH）是從新疆特色植物、國家重點保護野生藥材肉蓯蓉中分離、純化的苯乙醇苷類化合物的主要成分［1］。前期大量研究實驗結果證實，ECH有明顯的神經保護作用。主要表現在抗活性氧自由基損傷的作用［2］、抗神經元凋亡作用［3］、提高學習記憶能力［4］和抗衰老作用［5］。本實驗室研究發現松果菊苷有明顯的對抗腦缺血損傷中單胺類神經遞質升高的作用［6］。阿爾采末病（Alzheimer’s disease，AD）是一種多病因的以進行性認知障礙和記憶能力損害為特征的中樞神經系統退行性疾病。AD是繼心血管疾病、癌癥和腦卒中之后第四大病魔，并隨著人口老齡化日益嚴重，AD的發病率呈明顯上升趨勢。本文通過觀察ECH對氧自由基引起的AD模型大鼠學習、記憶功能的影響，初步探討ECH改善AD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 ECH由北京大學屠鵬飛教授惠贈 （純度95%以上）；Aβ25-35、D-半乳糖（Sigma公司）；石杉堿甲片 （哈伯因，河南太龍藥業股份有限公司，批號：120708）；SOD、MDA、NO、NOS試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物 SD大鼠，♂，體質量290～320 g，購自新疆實驗動物研究中心，許可證編號：SCXK（新）：2011-0002，飼養條件為室溫20℃ ～23℃，濕度為50%～70%，自由進水、攝食，自然光照。

1.3 主要儀器 DMS-2型Morris水迷宮，中國醫學科學院藥物研究所；美國 BAS 4100型大鼠腦立體定位儀；Varioskan Flash 4.00.51酶標儀，美國Thermo electron公司。

2 方法

2.1 Aβ25－35的孵育［7］0.9% 無菌生理鹽水加入Aβ25-35（2 g·L-1），保存在 -20℃，使用前在37℃恒溫箱孵育7 d，使其變成凝聚態。

2.2 模型建立 大鼠采用腹腔注射D-半乳糖，100 mg·kg-1，每天1次，共計56 d，于d 43腹腔注射10%水合氯醛（3.5 ml·kg-1），等到大鼠翻正反射消失后，固定于大鼠腦立體定位儀上，前齒與雙內耳保持在同一水平面，顱頂部備皮，縱行切口約1 cm并暴露硬骨膜，參照George Paxinos《大鼠腦立體定位圖譜》［8］，以前鹵為基點，定位于大鼠右側海馬（坐標 AP：＋3.5 mm；ML：＋2.0 mm；DV：-3.0 mm），骨科鉆在定位處打孔，用5μl微量注射器開孔處垂直進針，注射速度調至1μl·min-1，注射時間5 min，勻速注射5μl凝聚態 Aβ25-35，并留針5 min，使溶液充分彌散，緩慢退針。縫合切口，每只大鼠注射0.2 ml硫酸慶大霉素防治感染。假手術組與模型組每日同時腹腔注射等量的生理鹽水，43 d相同部位腦內注射等容積的生理鹽水。

2.3 分組及給藥 將復制成功的60只AD模型大鼠隨機分為6組，每組10只，按以下劑量分別腹腔注射給予：ECH低劑量組 （10 mg·kg-1）、ECH中劑量組 （20 mg·kg-1）、ECH高劑量組 （40 mg·kg-1）、陽性藥石杉堿甲組 （Hup-A，0.02 mg·kg-1）、模型組和假手術組 （生理鹽水 1 ml·kg-1），每天1次，連續4周。

2.4 學習記憶能力測試 用Morris水迷宮方法衡量各組大鼠學習記憶的能力，實驗可分為：①前5 d進行定向航行試驗：記錄2 min內大鼠依次從4個象限入水到爬上平臺所需時間（逃避潛伏期）。②d 6撤去平臺，進行空間探索實驗：記錄大鼠由相同入水點在2 min內穿過原平臺位置的次數及路徑長度。

2.5 SOD、MDA、NO、NOS試劑盒測定 Morris水迷宮測試結束后，按照試劑盒說明書要求，嚴格操作，測定各組大鼠皮質、海馬組織中SOD、MDA、NO、NOS的活性。

2.6 統計學分析 結果數據均以±s表示，采用SPSS 17.0統計分析軟件，t檢驗進行組間比較。

3 結果

3.1 ECH對AD大鼠學習記憶能力的改變 不斷連續的訓練，使得各組大鼠的逃避潛伏期隨著訓練的次數增加而縮短，但在測試的d 4、d 5，模型組大鼠相比ECH低、中、高、石杉堿甲組的逃避潛伏期差異具有顯著性（P＜0.01，P＜0.05）；d 6模型組2 min內穿越平臺次數明顯少于其他各組的次數（P＜0.05）。見 Tab 1，Fig 1、2。

Tab 1 Results of place navigation test of Morriswater maze of ratsˉx±s，n＝10）

Tab 1 Results of place navigation test of Morriswater maze of ratsˉx±s，n＝10）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Treatment group Latency/s Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Sham - 55.03±21.24 49.60±17.19 26.77±9.97 20 Dose/mg·kg-1.18±6.34 7.55±5.31 Model - 59.52±20.63 56.88±14.32 57.39±6.37＃ 53.28±9.71＃＃ 43.21±14.89＃＃ECH-L 10 61.32±10.15 45.37±17.13 37.10±6.26** 33.96±8.52* 18.04±6.65**ECH-M 20 57.49±18.52 41.82±18.02 34.71±8.45** 26.89±11.57** 16.79±5.39**ECH-H 40 56.18±15.39 44.79±12.54 35.03±7.19** 23.55±10.03** 13.69±4.28**Hup-A 0.02 58.63±11.25 43.50±15.42 36.66±8.84** 27.17±7.37** 14.78±4.41**

Fig 1 Result of spatial probe test of Morriswater maze of rats（ˉx±s，n＝10）＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Fig 2 Representative paths from the place navigation test

3.2 ECH對各組大鼠腦組織中NO、MDA含量和SOD、NOS活性的影響 見Tab 2，3。

4 討論

Morris水迷宮是目前較為客觀的、最常用于驗證認知疾病模型的建立、評價與腦功能有關的學習記憶的能力和判定神經認知治療有效性［9］。大鼠的空間記憶能力越好，其逃避潛伏期越短，于空間探索航行即大鼠穿越平臺的次數越多。實驗結果顯示，AD模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿過平臺的次數明顯下降，游泳路徑多為邊緣式和隨機式，證明其空間學習記憶能力嚴重下降；ECH低、中、高劑量組均使大鼠學習記憶能力不同程度的提高，3組潛伏期明顯低于模型組，ECH高劑量組與石杉堿甲組比較差異無顯著性，提示ECH對D-半乳糖聯合Aβ25-35導致的獲得性記憶損傷有改善作用。

過量的氧自由基被認為是引起大腦內神經元細胞損傷、神經元密度降低造成動物學習記憶能力退化的潛在因素［10］。腦組織是自由基連鎖反應和脂質過氧化作用的靶組織，由于大腦的耗氧量最高，其豐富的脂質含量和相對于其它組織缺乏的抗氧化酶水平使其特別容易受到自由基損傷［11］，因此最常見的檢測指標為 NO、MDA的含量及NOS、SOD的活性。研究表明Aβ沉積和神經纖維纏結是AD的主要發病機制［12］，氧自由基能促進Aβ聚積和神經纖維纏結，并且同時Aβ也伴隨著生成更多的氧自由基，這便直接導致了大量神經元細胞丟失。D-半乳糖在機體內代謝產物為半乳糖醇，不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內，影響細胞的正常滲透壓，導致細胞腫脹，功能代謝紊亂，動物隨之產生行動遲緩，在此基礎上給予Aβ加重了多方面因素導致的學習記憶能力的下降。MDA水平反映脂質過氧化的程度，SOD將超氧自由基轉化為過氧化氫，進而在過氧化氫酶的存在下繼續分解為水和氧氣，因此SOD和過氧化氫酶構成第一個抗活性氧的防御機制。本實驗室前期研究發現，由Aβ誘發的AD模型大鼠腦內興奮性氨基酸含量升高，過度激動N-甲基-D-天冬氨酸 （NMDA）受體，大量 Ca2＋內流，導致細胞內Ca2＋超載，激活NOS，引起NO大量釋放。NO不僅是參與學習記憶過程的主要遞質之一，而且還有很強的神經毒性作用。實驗結果顯示Aβ致使體內NO與NOS表達異常，有可能是癡呆形成的重要病理機制之一。本研究結果表明，與模型組相比，ECH中、高劑量組對所檢測的4項指標均有不同程度的改善。ECH可以提高AD大鼠皮質、海馬組織中SOD的活性，降低MDA含量，減少NO、NOS生成的結果，提示ECH具有增強機體清除自由基的能力，可以對大鼠大腦海馬組織內注射Aβ25-35誘發的氧化損傷有較好的保護作用。

ECH能夠明顯提高學習記憶能力，其機制可能與抵抗了D-半乳糖引起的大鼠海馬組織中淀粉樣沉淀沉積所帶來的不良影響，并促進氧自由基清除，減少氧自由基損傷引起的細胞變形及丟失有關。但ECH其他方式的腦保護作用機制尚需做更深入的研究。

Tab 2 SOD and NOS activity，NO and MDA level in cerebral cortex of rats（±s，n＝10）

Tab 2 SOD and NOS activity，NO and MDA level in cerebral cortex of rats（±s，n＝10）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Treatment group Dose/mg·kg-1 SOD/kU·g-1 MDA/μmol·g-1 NO/μmol·g-1 NOS/kU·g-1 Sham - 46.73±4.12 2.01±0.12 3.60±2.35 0.88±0.16 Model - 18.32±2.56＃＃ 2.88±0.15＃＃ 8.77±3.14＃ 2.90±0.20＃＃ECH-L 10 24.66±1.19 2.72±0.31 6.06±2.53 2.28±0.27*ECH-M 20 38.25±4.60** 2.48±0.26* 4.22±3.05 1.73±0.57**ECH-H 40 43.79±3.42** 2.30±0.24** 4.01±2.39* 1.10±0.25**Hup-A 0.02 45.21±5.30** 2.14±0.12** 3.93±2.59* 1.09±0.29**

Tab 3 SOD and NOS activity，NO and MDA level in hippocampus of rats（±s，n＝10）

Tab 3 SOD and NOS activity，NO and MDA level in hippocampus of rats（±s，n＝10）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

Treatment group Dose/mg·kg-1 SOD/kU·g-1 MDA/μmol·g-1 NO/μmol·g-1 NOS/kU·g-1 Sham - 59.66±7.34 2.80±0.23 15.88±2.97 1.40±0.19 Model - 34.13±6.85＃＃ 4.40±0.17＃＃ 29.63±2.03＃＃ 3.65±0.13＃＃ECH-L 10 41.97±4.18 3.99±0.25* 23.17±3.11* 3.31±0.21 ECH-M 20 50.52±2.91** 3.48±0.29** 19.67±2.85** 3.07±0.32*ECH-H 40 56.81±2.84** 3.12±0.18** 16.96±2.30** 1.65±0.28**Hup-A 0.02 58.69±5.26** 3.05±0.11** 16.33±2.37** 1.53±0.66**

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