杜仲提取物中4種主要成分在Caco-2細胞的攝取特性研究

蘭燕宇，劉 躍，曹 旭，牟景麗，王愛民，鄭 林

（貴陽醫學院1.藥學院貴州省藥物制劑重點實驗室、2.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）又名木綿、思仙、思仲、絲棉皮、扯絲皮、川杜仲等，為杜仲科植物杜仲屬的落葉喬木。其皮、莖、葉均可入藥，是一味名貴中藥材，主要產于貴州、四川、湖北、浙江等省［1］。國內外對杜仲的化學成分和藥理作用的研究已取得很大的進展，研究結果表明，其中木脂素類化合物（松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷）是杜仲的主要降壓部位，能較好地代表杜仲的整體效應，其降壓作用確切，具有良好的開發前景，另京尼平苷酸具有預肪性功能低下、增強記憶功能、抗癌、抗氧化、瀉下、促進膽汁分泌及降壓作用［2］。Caco-2細胞系（human colon carcinoma cell line）來源于人結腸腺癌細胞，容易在體外培養，其同源性較好，結構和生化作用類似于人小腸上皮細胞，含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系，可獲得藥物的攝取、跨膜轉運及代謝等信息［3］。把Caco-2細胞模型作為體外中藥復方藥效研究的“藥篩”工具，將中藥中大量不能被吸收的復雜成分在體外實驗前先行“篩”去，以此增加中藥復方制劑體外實驗與體內實驗的相關性。因此，本試驗采用Caco-2細胞模型，結合UPLC-MS/MS法考察杜仲提取物中主要成分松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷苷、京尼平苷酸、原兒茶酸在Caco-2細胞中的攝取特點，國內外未見相關文獻報道，以期為杜仲提取物的口服制劑研發提供一定的科學依據，并為中藥的體外吸收機制研究提供參考［4-5］。

1 材料

1.1 儀器 超高液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（美國Waters公司）；Allegra 64R高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；ZH-2渦旋混合器（天津藥典標準儀器廠）；CQ 250A-TS超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）；CO2培養箱（Thermo scientific）；超凈工作臺（蘇州凈化設備總廠）；Millicell-ERS電位儀（美國 Millipore公司）；功能酶標儀（Thermo3001 VARIOSKAN FLASH）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；TGL-16G離心機。

1.2 試劑與試藥 京尼平苷酸（批號27741-01-1）、松脂醇二葡萄糖苷（批號201206）、松脂醇單葡萄糖苷（批號070801）、原兒茶酸（批號 X20-20121012）和葛根素（批號110752-200912）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；杜仲提取物自制（批號：20130823）；DMEM培養基（Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，Gibco）、胎牛血清（fetal bovine seurm，Biochrom）、青、鏈霉素、Hank′s緩沖溶液（HBSS，Gibco）；胰蛋白酶（Trypsin，Sigma）；考馬斯亮藍（20130523，南京建成生物工程研究所）；DMSO、甲醇、乙腈均為色譜純；實驗用水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 細胞株 Caco-2細胞株（上海中科院），實驗用的細胞傳代數在50代以內。

Fig 1 SIR chromatogramsA：Blank cell suspension；B：Blank cell suspension spiked with standands；C：Caco-2 cell sample；1：Geniposidic acid；2：Protocatechuic acid；3：Puerarin；4：Pinoresinol diglucoside；5：Pinoresinol singleglucoside

2 方法與結果

2.1 細胞攝取特性考察方法［6-8］參照文獻［9］方法進行細胞培養，將培養14 d的細胞用37℃、pH 7.4的HBSS緩沖溶液在培養箱中培養20 min后，吸去緩沖溶液。用HBSS緩沖溶液輕輕沖洗兩遍，洗去細胞單分子層表面的雜質。加入含藥的HBSS溶液2 ml，置37℃的培養箱中，分別考察培養時間（15、30、60、90、120、180 min）、不同濃度（0.2、0.5、1、2、5 g·L-1）、培養介質不同 pH（4.0、5.0、6.0、7、8）、不同溫度（4、25、37）℃以及抑制劑（P-糖蛋白抑制劑維拉帕米、頭孢菌素A）對杜仲提取物細胞攝取的影響。按攝取時間取出后，加入4℃的HBSS快速清洗3遍細胞單分子層，加入0.1%Triton X-100（pH 7.4的HBSS溶液配制）細胞裂解液500μl，反復凍融裂解細胞，取出細胞超聲10 min，得細胞懸液。取300μl細胞懸液，加入10μl內標，300μl甲醇沉淀蛋白，渦混1 min，15 000 r·min-1離心5 min，取上清2μl進樣分析，測定京尼平苷酸等4種成分的濃度；另取10μl細胞懸液以考馬斯亮藍法測定蛋白含量。攝取量以mg（藥物）/g（蛋白）表示。

2.2 分析條件 色譜條件：Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）色譜柱；0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，梯度為0～0.5 min：5%～10%，0.5～3.5 min：10% ～20%，3.5～4 min：20% ～90%，4～5 min：90%～5%，；流速為0.35 ml·min-1；柱溫：45℃。進樣體積為2μl。

質譜條件：Waters Acquity TQD質譜儀，MassL-ynxV4.1工作站，電噴霧電離源（ESI）；毛細管電壓：3kV；離子源溫度：120℃；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣為氮氣（650 L· h-1）；碰撞氣為氬氣（0.16 ml·min-1）；掃描方式為選擇離子監測模式（SIR），用于定量分析的京尼平苷酸、原兒茶酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷及葛根素（內標）監測離子反應分別 m/z 373.2；m/z 152.9；m/z 681.3；m/z 519.3；m/z 417.0。

2.3 標準溶液的配制 精密稱取京尼平苷酸、原兒茶酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷適量，用甲醇定容至10 ml，獲得京尼平苷酸（1.350 g·L-1）、原兒茶酸（0.974 g·L-1）、松脂醇二葡萄糖苷（1.000 g·L-1）、松脂醇單葡萄糖苷（1.010 g·L-1）的儲備液。置冰箱（-20℃）保存，備用。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 比較空白細胞混懸液A、混合對照品溶液B和細胞樣品C的色譜行為，在建立的色譜條件下考察其專屬性。京尼平苷酸等4種成分及葛根素（內標）的保留時間（RT）分別為 0.99、1.08、1.83、2.40、3.73 min，由 Fig 1可以看出，成分間分離良好，空白細胞混懸液無雜質干擾。

2.4.2 線性關系的考察 取空白細胞混懸液300 μl，依次加入50μl混合標準溶液，10μl內標溶液及300μl甲醇沉淀蛋白，其余按“2.1”項下操作，建立標準曲線。以待測物的峰面積與內標峰面積之比（A/Ai）為縱坐標Y，各物質濃度（C）為橫坐標X進行直線回歸，權重系數為1/X，求得直線方程，即為標準曲線。京尼平苷酸（Y＝1.158X＋0.56，r＝0.995，0.07～15.98 mg·L-1），原兒茶酸（Y＝2.50X＋0.01，r＝0.997，0.02～5.76 mg·L-1），松脂醇二葡萄糖苷（Y＝0.55X＋0.06，r＝0.996，0.05～11.83 mg·L-1），松脂醇單葡萄糖苷（Y＝1.46X-0.16，r＝0.995，0.05～11.95 mg·L-1），各成分最低檢測限（LOD）分別為 3.30、10.27、17.41、11.67 mg·L-1。

2.4.3 準確度和精密度 按“標準曲線”項下分別配制4個成分的低、中、高3個濃度的質量控制樣品（QC），每一個濃度進行5樣本分析，連續測定3 d，代入當日標準曲線中，分別計算各物質的濃度，求算日間RSD%和準確度。每一個濃度進行5樣本分析，日內連續進樣，并與標準曲線同時進行。求得京尼平苷酸等4個成分準確度為88.99%～105.15%；日內精密度RSD%為1.29%～13.29%；日間精密度RSD%為1.60%～5.36%。

2.4.4 穩定性實驗 用空白細胞混懸液配置上述高濃度的混標溶液，室溫放置，分別在1、2、3 d，在所確定的質譜條件下分析，根據京尼平苷酸、原兒茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷色譜峰面積，計算其RSD分別為0.33%、3.23%、4.08%和2.43%。結果表明，杜仲提取物樣品溶液在3 d內室溫放置條件下穩定性均良好。

2.4.5 回收率 按“標準曲線”項下配制低、中、高濃度同時含4種成分的溶液，但不加入內標，所確定的質譜條件下分析，每個濃度重復3次，經LC-MS/MS測定值與相應濃度直接用流動相配制的樣品溶液測定值的比值計算回收率。回收率均大于85%。

2.5 統計學分析 統計分析所得數據以ˉx±s表示，組間差異比較用t檢驗。多組比較，用單因素方差分析。

2.6 Caco-2細胞攝取實驗結果

2.6.1 不同濃度受試化合物對Caco-2細胞毒性實驗 選取對數生長期Caco-2細胞，以每孔100μl，1×108～2×108個·L-1種植于96孔培養板中，將培養板置37℃、5%CO2培養箱中孵育48 h。實驗分為正常對照組、藥物組。正常對照組每孔加入100 μl DMEM培養液；藥物組：將杜仲提取物稀釋至不同體積比濃度：0.5、5、10、20、40 g·L-1，每孔加入100μl，作用Caco-2細胞4 h后，用MTT法檢測。每個濃度平行5孔，實驗重復3次。抑制率/%＝（對照組OD-實驗組OD）/對照組OD×100%。

實驗結果表明，在所設置的濃度范圍內，隨著濃度的增加，杜仲提取物對Caco-2細胞的生長具有抑制作用，提取物濃度在5 g·L-1以上時有細胞毒性（P＜0.05），因此，實驗選擇濃度在5 g·L-1以下進行下一步的攝取實驗。

2.6.2 濃度依賴性攝取實驗 取不同濃度（0.2、0.5、1、2.5、5 g·L-1）的杜仲提取物的 Hank′s溶液，然后加入Caco-2細胞中，培養60 min，考察藥物濃度對細胞攝取的影響。結果表明，在0.2～5 g·L-1內杜仲提取物中的京尼平苷酸等4個成分的細胞攝取量與濃度呈線性關系，其回歸相關系數（r2）均達到0.990以上，表明京尼平苷酸等4種成分的攝取主要表現為被動擴散。結果見Fig 2。

Fig 2 Effect of extract with different concentrations on uptake by Caco-2 cellmonolayers

2.6.3 不同時間對Caco-2細胞攝取的影響 將5 g·L-1杜仲提取物加到細胞中，分別考察不同攝取時間（15、30、60、90、120、180 min）對 Caco-2細胞攝取的影響。結果顯示，在不同的攝取時間下，杜仲提取物中的京尼平苷酸、松脂醇單葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷3個成分的細胞攝取量都隨著時間的增加而攝取增加，而原兒茶酸隨著時間的增加攝取量緩慢降低。綜合此結果，本實驗將細胞攝取時間定為60 min。結果見Fig 3。

2.6.4 pH值對Caco-2細胞攝取的影響 將5 g·L-1杜仲提取物分別溶于不同 pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的 Hank′s中，在加藥 60 min后測定不同pH值對Caco-2細胞攝取杜仲提取物的影響。結果表明，在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0條件下，杜仲提取物中的京尼平苷酸、原兒茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷4個成分的細胞攝取量隨著pH的增加，攝取量逐漸降低。結果表明，堿性環境不利于京尼平苷酸等4種成分的吸收，再考慮到小腸的吸收環境，實驗選擇pH 6作為后續實驗的pH環境。結果如Fig 4所示。

Fig 3 Time-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

Fig 4 pH-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

2.6.5 不同溫度對Caco-2細胞攝取的影響 將5 g·L-1杜仲提取物加到培養好的細胞中，分別在pH 6、加藥60 min后測定不同溫度（4、25、37℃）對 Caco-2細胞攝取杜仲提取物的影響。結果表明，在不同溫度下，杜仲提取物中的京尼平苷酸等4個成分的細胞攝取量都隨著溫度的增加而增加，37℃環境下更有利于細胞的攝取。結果如Fig 5所示。

2.6.6 抑制劑對Caco-2細胞攝取的影響［10］按上述所確定的pH 6、37℃作為攝取條件，分別加入含同濃度的杜仲提取物（5g·L-1）溶液、含維拉帕米（25 mg·L-1）的杜仲提取物溶液、含環孢菌素A（10 mg·L-1）的杜仲提取物溶液，分別于給藥60 min后，測定有無抑制劑存在時Caco-2細胞對杜仲提取物攝取的變化，數據用ˉx±s表示，采用SPSS 18軟件，統計采用單因素方差分析。結果見Tab 1。

Fig 5 Tem perature-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

Tab 1 Effect of cyclosporine A and verapam il on uptake byCaco-2 cellmonolayers（±s，n＝3）

Tab 1 Effect of cyclosporine A and verapam il on uptake byCaco-2 cellmonolayers（±s，n＝3）

*P＜0.05 compared with extract.

Composition Uptake/mg·g-1Pro Geniposidic acid 1.08±0.06 Cyclosporine A＋Geniposidic acid 1.04±0.06 Verapamil＋Geniposidic acid 1.08±0.08 Protocatechuic acid 0.4±0.03 Cyclosporine A＋Protocatechuic acid 0.46±0.02*Verapamil＋Protocatechuic acid 0.52±0.04*Pinoresinol diglucoside 1.98±0.14 Cyclosporine A＋Pinoresinol diglucoside 1.89±0.09 Verapamil＋Pinoresinol diglucoside 2.04±0.12 Pinoresinol singleglucoside 0.61±0.01 Cyclosporine A＋Pinoresinol singleglucoside 0.59±0.03 Verapamil＋Pinoresinol singleglucoside 0.61±0.02

3 討論

藥物口服后，小腸是主要的吸收部位，目前應用較多的腸吸收實驗方法有：在體腸灌流法（in situ intestinal perfusion）、外翻腸環法（evetred intestinal rings）、外翻腸囊法（evetred gut sacs）和 Caco-2細胞模型法（Caco-2 cell model）等［11］。其中，Caco-2細胞是研究藥物腸吸收的理想模型，因接近藥物在人體內吸收的實際環境，并具有較高的重現性，兼具快速、易于控制、干擾小、可連續檢測等優點，而成為近年來國際公認的用于高通量研究藥物腸吸收的常用工具模型［12］。

本實驗發現，杜仲提取物在0.2～5 g·L-1內，攝取量受時間、濃度、pH的影響，Caco-2細胞的攝取量與藥物濃度呈良好的線性關系，由于在各自相應濃度范圍內，細胞攝取表現出一級速率過程的特征，表明杜仲提取物的攝取機制可能為被動擴散。在酸性環境下有利于京尼平苷酸等4種成分的攝取，在中性、偏堿性條件下，藥物的攝取明顯降低。這可能是由于京尼平苷酸等具有酚羥基結構，顯弱酸性，所以中性、偏堿性條件下水解為鹽的形式，從而導致膜滲透性降低。隨著溫度的增加，細胞內酶的活性增加，細胞攝取量也隨之增加。

Caco-2細胞表達多種主動轉運載體如P-gp、多藥耐藥相關蛋白（MRP2）等。P-gp可將其底物藥排出細胞，降低細胞內藥物濃度，P-gp抑制劑可抑制P-gp的外排功能，增加P-gp底物的細胞內濃度。本實驗采用Caco-2細胞攝取方法考察京尼平苷酸等4種成分是否是P-gp的底物。實驗結果表明，環孢菌素A和維拉帕米對京尼平苷酸等3種成分的攝取量沒有明顯增加作用，說明京尼平苷酸等3種成分的攝取過程中沒有P-gp的參與，而原兒茶酸細胞攝取量明顯高于對照組（P＜0.05），即京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷不是P-gp的底物，原兒茶酸是P-gp的底物。

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