兩色金雞菊醇提物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠尿液的代謝組學(xué)研究

盧 偉，馬曉麗，蘭 怡，李琳琳，王 燁，靳春麗，毛新民，4

（新疆醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)學(xué)院藥理學(xué)教研室、2.分析測(cè)試中心、3.附屬中醫(yī)院、4.中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011）

代謝組學(xué)是近年來新興的一門學(xué)科［1-2］，可以從整體水平上研究生物體受外界環(huán)境攪動(dòng)后，體內(nèi)小分子物質(zhì)的變化。作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，它已被廣泛應(yīng)用于藥物毒性分析、新藥篩選及復(fù)雜疾病的作用機(jī)制研究。高血壓病是一種整合遺傳因素和環(huán)境因素（鈉鹽、酒精過量和肥胖）的復(fù)雜疾病，尤其具有家族聚集性［3-5］，目前對(duì)其研究表明，其發(fā)生與糖代謝、脂代謝及氨基酸等小分子代謝紊亂有密切關(guān)系［6］。

兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria Nutt.），又稱“昆侖雪菊”［7］，屬菊科（Compositae）金雞菊屬（Coreopsis）一年生草本植物。研究表明將其當(dāng)茶飲用，具有降血壓、降血脂、降血糖的功效［8］。但其具體的作用機(jī)制尚不明確。本研究工作嘗試建立一種兩色金雞菊醇提物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠代謝干預(yù)的代謝組學(xué)評(píng)價(jià)方法，采用NMR分析方法測(cè)定給藥組和對(duì)照組大鼠的尿樣，得到尿樣中小分子代謝物的圖譜，結(jié)合主成分分析（P-LS-DA）方法，考察小分子內(nèi)源性代謝物受金雞菊醇提物灌胃影響而產(chǎn)生的變化，探討金雞菊提取物長(zhǎng)期給藥后，高血壓大鼠尿液代謝物的變化。

1 材料

1.1 動(dòng)物 ♂自發(fā)性高血壓大鼠（SHR），40只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；♂ Wistar大鼠，8只，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001；飼養(yǎng)環(huán)境光照12 h/天，溫度（21±2）℃，濕度45%～55%。

1.2 藥物及試劑 新疆兩色金雞菊醇提物中試凍干粉（烏魯木齊三高和藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：20121217）。卡托普利片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：1211031）；杜仲平壓片（貴州三仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20121206）；重水（Cambridge I-sotope Laboratories， Inc產(chǎn) 品 ）；NaCl、K2HPO4、NaH2PO4（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所 ），TSP，核磁管，蒸餾水。

1.3 試劑和儀器 BP-98A無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)（北京軟隆生物技術(shù)有限公司）；TDL-5M型大容量低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；KDC-2046型低溫離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；AB204-N型分析天平（梅特勒-托勒德）；電子天平（中山市衡新電子有限公司）；Inova 600型核磁共振波譜儀（美國(guó)Varian公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 將11周齡的SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)2 d測(cè)量大鼠血壓，將2 d的血壓取均值，然后，按照大鼠血壓值均衡隨機(jī)分為6組，分別為：模型組（6只）、杜仲片組（6只，187.5 mg·kg-1）、卡托普利組（7只，4 mg·kg-1）、兩色金雞菊醇提物低劑量組（7只，0.8 g·kg-1）、中劑量組（7只，1.6 g·kg-1）、高劑量組（7只，3.2 g·kg-1），8只Wistar大鼠為空白組。各組喂食普通飼料，自由進(jìn)水。各組大鼠每天灌胃1次，灌胃容積為10 ml·kg-1。連續(xù)灌胃給藥4周。

2.2 血壓測(cè)定 每5 d采用BP-98A無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)量血壓1次。操作時(shí)，先將大鼠裝進(jìn)保溫套中，加熱5 min左右，連續(xù)測(cè)量5～6次，取收縮壓（SBP）平均值為該大鼠的血壓值。

2.3 尿液收集和處理 采用代謝籠，分別于造模后 1、2、3、4周末，收集大鼠夜間 12 h尿液，置于-20℃冰箱保存，備用。NMR分析前，尿樣解凍至室溫，12 000 r·min-1離心 10 min，取出上清液，裝入干凈的EP管中，每個(gè)尿液樣本各取400μl，每個(gè)樣本加入200μl重水配制的磷酸緩沖液中，室溫放置 10 min，，以 10 000 r·min-1離心 10 min，取上清液550μl，放入5 mm核磁管中進(jìn)行NMR測(cè)試。

2.4 NMR條件 尿液1H核磁共振圖譜（1H-NMR譜）：采用Inova600型核磁共振波譜儀調(diào)用NOESYPRESAT-1D（RD-90○-t1-90○-tm-90○-ACQ）脈沖序列進(jìn)行氫譜測(cè)定。NMR條件：對(duì)1H核共振頻率為500.13 MHz，累積掃描64次，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)32 768，譜寬 20 mg·L-1，采樣延遲 2 s，每次掃描時(shí)間均為1.64 s，測(cè)試溫度25℃，采用預(yù)飽和方法壓制水峰。

2.5 數(shù)據(jù)分析 進(jìn)行基線及相位調(diào)整后，選擇H為10.0～0.5ppm的區(qū)域進(jìn)行自動(dòng)積分，積分區(qū)間設(shè)為0.003 ppm。為了消除飲水量對(duì)代謝物濃度的影響，積分值進(jìn)行歸一化處理（每一段積分值除于所有積分值之和），并用SMICA-P＋（瑞士）軟件進(jìn)行最小方差判別分析法（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）。

3 結(jié)果

3.1 SHR大鼠SBP的變化 給藥前，與空白組相比，模型組血壓明顯高于空白組（P＜0.01）；而其他各組大鼠血壓與模型組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)1周后，與模型組相比，卡托普利組、兩色金雞菊醇提物中、高劑量組大鼠血壓較模型組有明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。干預(yù)2周后，陽(yáng)性藥卡托普利組、兩色金雞菊醇提物中、高劑量組中大鼠血壓較模型組有明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；陽(yáng)性藥杜仲片組血壓也有下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從第3周開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各干預(yù)組大鼠血壓持續(xù)下降，與模型組相比均有明顯下降（P＜0.01），而在實(shí)驗(yàn)期間，模型組大鼠血壓持續(xù)穩(wěn)定在一定水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩色金雞菊具有較好的降低SHR大鼠血壓的作用。見Tab 1。

3.2 SHR大鼠尿液代謝物圖譜分析 應(yīng)用NMR技術(shù)獲得了各組給藥大鼠及模型組大鼠的尿液代謝譜，根據(jù)位移值分析出15種代謝物質(zhì)（Fig 1）。由于肉眼無(wú)法對(duì)不同組別見代謝物進(jìn)行差異比較，因此選取了多元統(tǒng)計(jì)分析中的PLS-DA，分析兩色金雞菊是否對(duì)高血壓大鼠的代謝產(chǎn)生影響。Fig 2提供了給藥第3周各組大鼠尿液代謝產(chǎn)物的偏最小分析得分圖。從Fig 2可見，SHR模型組與陽(yáng)性藥物組以及兩色金雞菊給藥組存在一定的代謝差異。陽(yáng)性藥物杜仲降壓片的代謝模式較正常與模型組均較遠(yuǎn)，可能該藥物對(duì)尿液的代謝影響不大；兩色金雞菊各給藥組的代謝模式較為規(guī)律，從小劑量組到大劑量組依次向正常組靠近，大劑量組最接近正常組的代謝模式，說明大劑量組的治療效果最好，與陽(yáng)性藥卡托普利組相似，提示兩色金雞菊組確有一定的療效，其作用也許并非通過直接降低血壓來實(shí)現(xiàn)，而是使失衡的代謝由疾病狀態(tài)恢復(fù)到正常狀態(tài)。

3.3 兩色金雞菊對(duì)SHR大鼠尿液代謝產(chǎn)物的影響Fig 3提供了兩色金雞菊大劑量組大鼠與SHR模型組大鼠尿液代謝產(chǎn)物的載荷圖。根據(jù)模型的擬合程度得到 R2X＝0.957，R2Y ＝0.544，Q2＝0.479，說明這個(gè)模型具有很好的擬合效果和良好的預(yù)測(cè)能力。圖中離中心越遠(yuǎn)的點(diǎn)即為代謝差異物質(zhì)，這些物質(zhì)可能是潛在的生物標(biāo)志物。將差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的物質(zhì)列于Tab 2。由Tab 2知，兩色金雞菊大劑量組處理后的大鼠尿液中有多種成分較模型組差異有顯著性，包括異亮氨酸、肌酸酐、葡萄糖等多種代謝產(chǎn)物，這些代謝物可能與兩色金雞菊治療高血壓的作用機(jī)制有關(guān)。

Tab 1 Change of SBP during experiments（±s）

Tab 1 Change of SBP during experiments（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group；＃＃P＜0.01 vs normal group

Group n 4 weeks Normal 8 127±2.7 127±5.3 126±5.7 127±4.1 125±BP/mmHg Before feeding with drug 1 weeks 2 weeks 3 weeks 4.4 Model 6 193±6.7＃＃ 191±4.1＃＃ 190±4.4＃＃ 190±4.5＃＃ 190±3.9＃＃Duzhong 6 192±6.8 186±3.9* 182±5.2* 174±4.4** 174±4.6**Captopril 7 190±8.6 175±2.3** 166±7.2** 155±6.1** 152±4.7**Low dosage 6 190±8.4 189±5.1 183±6.3 175±3.8** 174±5.5**Middle dosage 7 191±9.5 181±4.0** 176±5.4** 163±7.0** 160±5.7**High dosage 7 190±6.6 176±2.7** 171±5.7** 160±5.9** 159±6.0**

Fig 1 The NMR graph of the urine samples from rats1：Isoleucine；2：Citric acid；3：Scyllo inositol；4：Creatinine；5：Hippuric acid；6：Creatine；7：β-glucose；8：Acetone；9：Acetic acid；10：α-Ketoglutaric acid；11：Malic acid；12：Taurine；13：Choline；14：Allantoin；15：Dimethylamine

Fig 2 3D score p lots of the rats urine sam p les from different groupsnormal group； model group；captopril group；Duzhong tablets group； low dosage of extracts of Coreopsis tinctoria Nutt；middle dosage of Coreopsis tinctoria Nutt；high dosage of Coreopsis tinctoria Nutt.

Fig 3 Loading p lots of principal com ponent

Tab 2 Change ofmetabolics of SHR rats

4 討論

SHR作為一種遺傳性、自發(fā)性高血壓模型，是最能模擬人類高血壓的發(fā)生、發(fā)展過程的動(dòng)物模型。本次試驗(yàn)在對(duì)各組大鼠適應(yīng)性喂食1周后測(cè)定血壓，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血壓較正常Wistar大鼠明顯升高，連續(xù)觀察4周發(fā)現(xiàn)模型組與正常對(duì)照組大鼠的血壓非常穩(wěn)定，適于藥物干預(yù)觀察療效。試驗(yàn)選取了西藥卡托普利和中藥杜仲降壓片作為陽(yáng)性藥物，對(duì)比觀察兩色金雞菊不同劑量醇提物對(duì)SHR大鼠血壓及其生化指標(biāo)的影響。兩色金雞菊不同劑量組給藥4周后，動(dòng)物血壓明顯降低，效果與兩種陽(yáng)性藥物相似，說明其可以從整體水平上降低大鼠血壓。進(jìn)一步應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究高血壓大鼠代謝產(chǎn)物的變化，通過代謝產(chǎn)物的變化，研究藥物對(duì)高血壓大鼠的作用及可能的作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高血壓模型組與兩色金雞菊各劑量組具有較為清晰的代謝輪廓分布。陽(yáng)性藥物卡托普利的代謝物遠(yuǎn)離模型組大鼠的尿液代謝區(qū)域，而兩色金雞菊各劑量組的代謝分布也隨著劑量增加逐漸向正常組靠近，尤其大劑量組與卡托普利組非常接近，說明兩色金雞菊大劑量組與卡托普利治療高血壓的作用效果相似。為了更為準(zhǔn)確地觀察兩色金雞菊對(duì)高血壓大鼠代謝物的影響，選取模型組與大劑量組大鼠尿液樣品進(jìn)行PLS-DA的代謝模式比較，找出代謝差異變量。

從兩色金雞菊大劑量組與模型組尿液樣品的NMR譜及PLS-DA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多種代謝產(chǎn)物與高血壓病癥密切相關(guān)，與糖代謝相關(guān)的代謝物如β-葡萄糖、蘋果酸、丙酮也在本次試驗(yàn)被發(fā)現(xiàn)，如上述糖代謝物質(zhì)在模型組中均明顯升高，說明高血壓大鼠在血壓處于高值的同時(shí)還伴有葡萄糖代謝異常；另外，一些與腸道菌群有關(guān)的小分子物質(zhì)如膽堿、肌酸酐等也可能作為高血壓的標(biāo)志物。這些內(nèi)源性成分的改變提示模型組大鼠尿液存在相關(guān)代謝功能的異常，而經(jīng)過藥物干預(yù)后，這些指標(biāo)性成分會(huì)得到改善。

綜上所述，代謝組學(xué)可以從整體水平反映疾病治療過程中的小分子代謝變化，可與機(jī)體在藥物干預(yù)下發(fā)生的病理生理變化聯(lián)系起來，有助于更全面地闡述藥物的治療效果及分析作用機(jī)制。本研究通過觀察SHR大鼠尿液中的代謝產(chǎn)物變化，進(jìn)一步了解到兩色金雞菊減低SHR大鼠血壓可能與氨基酸代謝、糖代謝及小分子代謝通路有關(guān)。今后，還需要與蛋白組學(xué)等聯(lián)合分析，才能深入了解兩色金雞菊對(duì)高血壓作用的詳細(xì)機(jī)制。

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