桂枝湯對4-甲基鄰苯二酚誘導心臟交感神經芽生的抑制作用

李 曉，姜 萍，林海青，徐向東，楊金龍，馬度芳，于瀟華，姜月華

（1.山東中醫藥大學附屬醫院，山東濟南 250011；2.山東中醫藥大學臨床學院，山東濟南 250355）

在多種心臟疾病中，如心肌梗死、冠心病、心力衰竭等，交感神經損傷后進行修復，可能導致心臟交感神經的分布、密度和空間排布的改變，即心臟交感神經重構，主要表現為區域性交感神經去支配和高支配現象［1］，造成交感神經對心肌活動支配的不均一性，可進一步導致心肌電生理紊亂。交感神經失支配往往是由于交感神經纖維壞死或損傷導致，而交感神經高支配是在神經的修復過程中由于神經軸突芽生（axon regenernation or sprouting）引起，交感神經的這種重構現象多見于器質性損傷（如心肌梗死、心肌病）后的修復階段，如在心肌梗死后，在梗死區出現交感神經缺失，而在梗死區周邊心交感神經芽生和密度增高，易引起室顫和心源性猝死的發生［2］。

對于交感神經的不均一性，我們希望從中醫藥中尋找治療方藥。傳統中醫古方桂枝湯對動物的心率和血壓具有雙向調節［3］。臨床上用桂枝湯加減方治療冠心病、心律失常、低血壓、高血壓等循環系統疾病也取得一定的療效［4］。另外，采用桂枝湯或加味方［5-6］治療出汗異常、腸易激綜合癥、更年期綜合癥、神經源性膀胱等涉及自主神經紊亂的疾病也取得較好療效，由這些臨床經驗推斷，中醫方劑桂枝湯及其加減方或類方可以對交感神經起到雙向調節作用，這對交感神經的不均一性的治療是一個非常有探索價值的課題，本實驗僅對交感神經芽生作研究，并初步探索桂枝湯以及桂芍1∶2和2∶1不同配伍比例的作用差異。

4-甲基鄰苯二酚（4-methylcatechol，4-MC）是內源性神經生長因子（NGF）合成刺激劑，4-MC慢性注射可以誘導心交感神經芽生，增加交感神經分布密度，可用于建立心臟交感神經芽生大鼠模型［7］。目前研究表明，β受體阻滯劑如美托洛爾可降低交感神經張力［8］、抑制心肌梗死引起的交感神經芽生［9］。本研究觀察桂枝湯原方對4-MC誘導的大鼠心臟交感神經芽生是否具有抑制，并與美托洛爾的作用對比。

1 試劑與方法

1.1 實驗試劑與藥品 4-甲基鄰苯二酚（4-MC）（美國 Sigma-Aldrich公司產品，批號：452-86-8）；美托洛爾（阿斯利康制藥有限公司產品）；ELISA法檢測去甲腎上腺素（NE）、生長相關蛋白（GAP-43）、酪氨酸羥化酶（TH）、乙酰膽堿酶（CHAT）試劑盒（R＆D 公 司 產 品，貨 號 10391RT、10190RT、10234RT、10538RT，中國上海博蘊公司分裝，批號201120817）。兔抗大鼠酪氨酸羥化酶（TH）IgG多抗（英國Abcam公司產品，批號：ab51199）。TRITC標記的山羊抗兔IgG二抗（北京ZSGB-Bio公司產品，批號：ZF-0316）。山羊封閉血清（北京中杉金橋生物技術有限公司產品，批號：100418）。福田單道心電圖機，型號FX7000。

1.2 實驗動物與分組給藥 SPF級Wistar大鼠60只，♂，280～320g，由山東中醫藥大學實驗動物中心提供（許可證號：SCXK魯20110003）。取10只為正常對照組，注射等量生理鹽水。大鼠50只以4-MC 10 mg·L-1（10μg·kg-1體重）腹腔注射，每日 1次，誘導建立大鼠心臟交感神經芽生模型，連續注射30 d后，隨機分為模型對照組、美托洛爾組、桂枝湯1∶1組（桂芍1∶1組）、桂枝湯1∶2組（桂芍1∶2組）、桂枝湯2∶1組（桂芍2∶1組）。

桂枝湯組成藥物和美托洛爾（倍他樂克）購于山東省中醫院，桂枝湯方組成為桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大棗，按照比例，水煎煮，至終濃度為1.5 g（生藥）·ml-1（山東中醫藥大學附屬醫院制劑室加工制作）。倍他樂克（AstraZenecaAB公司，批號：CN52-039C-3633）配制為濃度0.15 g·L-1的混懸液。

給藥方法：美托洛爾組以美托洛爾10 mg·kg-1體重灌胃；桂枝湯1∶1組，4 g（生藥）·kg-1體重灌胃；桂枝湯1∶2組和桂枝湯2∶1組分別為5.5 g（生藥）·kg-1體重灌胃，灌胃量均為1 ml，連續灌胃30 d。正常對照組給予1 ml生理鹽水灌胃。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠心電圖 2%戊巴比妥鈉（20 mg·kg-1）腹腔注射淺麻醉，固定大鼠四肢，記錄大鼠肢體導聯的心電圖，并測量心率。心電圖共檢測3次，時間分別為造模前、注射4-MC 30 d時和灌胃30 d后。

1.3.2 標本的獲取 2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，腹腔取血，并迅速剪取心臟，冰生理鹽水漂洗，稱量全心重，并分離剪取右心房、左心室。右心房和左心室矢狀位平均剪成兩部分，一部分10%的中性甲醛固定，進行常規病理HE染色和免疫熒光觀察；另一部分右心房和左心室加入生理鹽水（1∶20）進行組織勻漿，ELISA法檢測心肌中的神經遞質和細胞因子的含量。

1.3.3 ELISA法檢測心肌勻漿中去甲腎上腺素（NE）、生長相關蛋白（GAP-43）、酪氨酸羥化酶（TH）、乙酰膽堿酶（CHAT） 嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 免疫熒光法觀察右心房、左心室中神經的分布 免疫熒光法檢測酪氨酸羥化酶（TH）。標本于-20℃厚度7μm切片，丙酮固定。PBS洗3 min×5次；山羊血清37℃封閉40 min；滴加兔抗大鼠酪氨酸羥化酶（TH）IgG一抗（1∶300），4℃過夜；PBS洗5 min×5次；滴加TRITC標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶100），37℃1 h；PBS洗5 min×3次。DAPI復染5 min，Leica DC-300F熒光顯微鏡暗視野下觀察拍照。

1.4 統計學分析 使用SPSS 17.0進行統計分析。數值以ˉx±s表示。除非另有說明，使用單因素方差分析（ANOVA）進行統計比較。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況 除去造模、灌胃等因素死亡，各組大鼠數量見Tab 1，各組大鼠間體重、一般狀態、解剖后心重均無差異；但模型對照組心重與體重比與正常對照組比較明顯升高，各用藥組心重與體重之比較模型對照組明顯下降（P＜0.05），見 Tab 1。

Tab 1 Ratio of heartweight and body weight of rats

2.2 大鼠心電圖和心率的變化 大鼠造模前、注射造模30 d和灌胃30 d的心電圖，J點和T波前后對比差異無顯著性，圖形差異無顯著性（Fig 1）。

在4-MC注射造模前，各組大鼠心率無差異。4-MC腹腔注射30 d后，各4-MC注射組心率均明顯上升（P＜0.05）；藥物灌胃治療30 d后，未治療的模型對照組大鼠心率仍高于正常對照組大鼠，各用藥組心率呈現不同程度的下降，其中桂枝湯1∶1組大鼠心率下降程度最大（Tab 2）。

Tab 2 Changes of heart rate of rats（bpm）

Fig 1 Electrocardiogram of each groupA：Normal group；B：Modelgroup；C：Metoprolol group；D：Guizhidecoction1：1 group；E：Guizhidecoction1：2 group；F：Guizhidecoction2：1 group

Fig 2 Immunofluorescence staining of TH positive nerve fibers in heart（×100，Bar：100μm）A：Normal group；B：Modelgroup；C：Metoprolol group；D：Guizhidecoction 1：1 group；E：Guizhidecoction 1：2 group；F：Guizhidecoction 2：1 group

2.3 心肌勻漿中NE、GAP-43、TH、CHAT的含量與正常對照組比較，模型對照組大鼠心肌內反映交感神經活性的NE、GAP-43和TH均明顯升高（P＜0.05），各組副交感神經標記物CHAT無差異，表明4-MC對副交感神經無影響。各用藥組NE、GAP-43、TH有不同程度的減少（P＜0.05），以美托洛爾組和桂枝湯1∶1組下降程度最為明顯，說明各藥物均可有效抑制交感神經芽生，但以美托洛爾組和桂枝湯1∶1組藥效最佳（Tab 3、4）。

2.4 免疫熒光 交感神經被標記為紅色，細胞核呈藍色。模型對照組右心房和左心室中TH陽性密度明顯高于其它組，即交感神經在心肌中分布密度增加，而各藥物治療組心臟交感神經分布趨于正常。相對于模型對照組，各藥物治療組心肌細胞排列較為規則，形態未出現明顯異常改變（Fig 2）。

Tab 3 Content of NE，GAP-43，TH and CHAT in right atrial

Tab 4 Content of NE，GAP-43，TH and CHAT in left ventricular

3 討論

缺血性心臟病在梗死周圍區域的心肌出現異常活躍的交感神經再生，大量的交感神經芽生造成心肌局部交感神經高支配現象，導致心臟中交感神經分布不均，是惡性心律失常和心源性猝死的重要原因之一。另外，交感神經亢進參與心肌肥大細胞激活局部組織腎素-血管緊張素系統的過程［10］。因此，抑制交感神經過度芽生，恢復心臟自主神經平衡是治療心臟疾病的重要目標之一。

研究結果顯示，給予大鼠注射4-MC后制備交感神經芽生模型，模型對照組心率明顯高于正常對照組，表明交感神經對心臟傳導系統的高支配現象。模型對照組大鼠心重與體重之比明顯高于正常對照組，可能是由于交感神經亢進使得心臟中神經內分泌紊亂，導致心肌細胞肥大增生，心肌外膠原沉積而出現心室組織重構［11］。GAP-43是一種在神經發育和再生過程中與軸突生長有關的膜結合磷酸化蛋白，存在于交感神經和迷走神經以及感覺神經中，其表達增加可作為神經生長和損傷后再生的標志［12-13］。TH可作為交感神經特異性的標志，且能反映交感神經活性［14］。CHAT為迷走神經的特異性標志物［15］。本研究顯示模型對照組大鼠心肌勻漿中GAP-43和TH均升高，而副交感神經的標志物CHAT未改變，同時，免疫熒光也顯示TH升高。表明4-MC可誘導交感神經增生，表現為交感神經分布和活性增高，而對副交感神經無明顯影響。而在給予藥物干預后，美托洛爾組心率和心重與體重之比均低于模型對照組，且心肌中的NE、GAP-43和TH也低于模型對照組，表明美托洛爾可抑制心臟中交感神經芽生，這與Yan等［16］的研究相同。相比美托洛爾組，桂枝湯桂芍不同配伍組也可減輕心臟中交感神經芽生，其中以桂芍1∶1組和桂芍1∶2組最為明顯，而且由免疫熒光可見，桂芍1∶1組與桂芍1∶2組心肌中交感神經分布少于美托洛爾組。因此，桂枝湯在抑制交感神經芽生方面作用與美托洛爾相同，其中桂芍1∶1配伍和桂芍1∶2配伍作用優于桂芍2∶1配伍。

美托洛爾作為最常用的β受體阻斷劑，在臨床上可用于降低交感神經張力，在心衰、冠心病的治療中不僅可以降低交感神經亢進，而且對心臟病的長期預后有明顯效果，之前的研究證明，β受體阻斷劑可減少離體豚鼠心臟和經麻醉狗的心臟中交感神經刺激引起的 NE釋放［17-18］。Yan等［16］的研究證明美托洛爾可降低心肌梗死后家兔心臟中交感神經芽生，減少心梗后心律失常的發生。但是，在交感神經重構中可同時存在交感神經高支配和失支配現象［8］，針對這種矛盾的病理現象，需要探索新的治療藥物，而根據中醫藥理論，中藥方劑桂枝湯具有潛在的雙向調節作用。由本實驗我們證明了桂枝湯可抑制交感神經芽生，并初步探索了不同桂芍配伍比例的作用差別，在針對交感神經重構這種相互矛盾的病理現象中，顯示出桂枝湯的治療優勢。

桂枝湯能有效降低心肌中NE、GAP-43、TH的含量，減輕4-MC誘導的心臟交感神經芽生，其中以桂芍1∶1配伍和桂芍1∶2配伍效果最好，作用與美托洛爾相似。

參考文獻：

［1］ Chen PS，Chen L S，Cao JM，etal.Sympathetic nerve sprouting，electrical remodeling and themechanisms of sudden cardiac death［J］.Cardiovasc Res，2001，50（2）：409-16.

［2］ Cao JM，Chen L S，KenKnight B H，et al.Nerve sprouting and sudden cardiac death［J］.Circ Res，2000，86（7）：816-21.

［3］ 秦彩玲，劉 婷，張 毅，等.桂枝湯對大鼠血壓雙向調節作用及其有效部位探討［J］.中國實驗方劑學雜志，2001，7（4）：20-3.

［3］ Qin C L，Liu T，Zhang Y，et al.Experiment studies on dual-directional regulation of Guizhitang for rat blood pressure and its active fractions of Guizhitang［J］.Chin JExper TraditMed Formul，2001，7（4）：20-3.

［4］ 王虎平，吳紅彥.桂枝湯功用述評［J］.中國實驗方劑學雜志，2008，14（2）：77-9.

［4］ Wang H P，Wu H Y.The statement and evaluation on function of ramuli-cinnamomi decoction［J］.Chin J Exper Tradit Med Formul，2008，14（2）：77-9.

［5］ 張保國，梁曉夏，劉慶芳.桂枝湯現代藥效學研究［J］.中國中藥雜志，2007，32（7）：557-61.

［5］ Zhang BG，Liang X X，Liu Q F.Modern pharmacodynamic study of Guizhi decoction［J］.China JChin Mat Med，2007，32（7）：557-61.

［6］ 曹愛梅.經方辨治糖尿病合并自主神經病變驗案5則［J］.國醫論壇，2003，2：8.

［6］ Cao A M.Fivemedical cases of treatment diabetic autonomic neuropathy with classical prescriptions［J］.Tradit Chin Med Forum，2003，2：8.

［7］ Saita K，Ohi T，Hanaoka Y，et al.A catechol derivative（4-methylcatechol）accelerates the recovery from experimental acrylamide-induced neuropathy［J］.JPharmacol Exp Ther，1996，276（1）：231-7.

［8］ 郭繼鴻.交感神經重構［J］.臨床心電學雜志，2008，17（4）：311-6.

［8］ Guo J H.Sympathetic remodeling［J］.J Clin Eletrocardiol，2008，17（4）：311-6.

［9］ Wang Y，Liu J，Suo F，etal.Metoprolol-mediated amelioration of sympathetic nerve sprouting after myocardial infarction［J］.Cardiology，2013，126（1）：50-8.

［10］Mackins C J，Kano S，Seyedi N，et al.Cardiacmast cell-derived renin promotes local angiotensin formation，norepinephrine release，and arrhythmias in ischemia/reperfusion［J］.J Clin Invest，2006，116：1063-70.

［11］Banki N M，Kopelnik A，Dae MW，etal.Acute neurocardiogenic injury after subarachnoid hemorrhage［J］.Circulation，2005，112：3314-9.

［12］嚴恒林.生長相關蛋白（GAP-43）與神經發育和再生［J］.神經解剖學雜志，1993，9（2）：155-62.

［12］Yan H L.Growth association protein is related to nerve development and regeneration［J］.JNeuroanatomy，1993，9（2）：155-62.

［13］Stewart H J，Cowen T，Curtis R，et al.GAP-43 immunoreactivity is widespread in the autonomic neurons and sensory neutons of the rat［J］.Neuroscience，1992，47（3）：673-84.

［14］Burgi K，CavalleriM T，Alves A S，etal.Tyrosine hydroxylase immunoreactivity as indicator of sympathetic activity：simultaneous evaluation in different tissues of hypertensive rats［J］.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300：264-71.

［15］Arvidsson U，Riedl M，Elde R，et al.Vesicular acetylcholine transporter（VAChT）protein：a novel and uniquemarker for cholinergic neurons in the central and peripheral nervous systems［J］.JComp Neurol，1997，378：454-67

［16］Yan SH，Hu H S，Wang X L，etal.Effectsofprolongedmetoprolol treatment on neural remodeling and inducible ventricular arrhythmias after myocardial infarction in rabbits［J］.Int J Cardiol，2007，117（3）：317-22.

［17］Yamaguchi N，de Champlain J，Nadeau R A.Regulation of norepinephrine release from cardiac sympathetic fibers in the dog by presynaptic alpha-and beta-receptors［J］.Circ Res，1977，41（1）：108-17.

［18］Adler-Graschinsky E，Langer SZ.Possible role of a beta-adrenoceptor in the regulation of noradrenaline release by nerve stimulation through a positive feed-backmechanism［J］.Br JPharmacol，1975，53（1）：43-50.