異丙腎上腺素致小鼠心肌纖維化模型的制備及評價

陳 蓉，謝梅林

（1.蘇州大學附屬第一醫院藥學部，江蘇蘇州 215006；2.蘇州大學醫學部藥理系，江蘇蘇州 215123）

心肌纖維化是多種心血管系統疾病終末期的共同病理表現，有效地抑制和逆轉心肌纖維化、心室重塑是目前臨床防止心力衰竭、心律失常及心源性猝死等嚴重不良事件的主要策略［1］，其形成機制復雜，涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）及多種細胞因子，是心血管研究領域的重點、難點課題之一。因此，建立一種簡單、經濟、可靠的心肌纖維化動物模型對于心肌纖維化的研究有著重要意義。

目前，實驗性動物心肌纖維化的造模方法有：①自發性高血壓大鼠（SHR）心肌纖維化［2］；② 糖尿病大鼠心肌纖維化［3］；③ 結扎腹主動脈或單側腎動脈致心肌纖維化［4］；④冠脈結扎法等引起心肌梗死心肌纖維化［5］；⑤異丙腎上腺素誘導心肌缺血損傷心肌纖維化［6］；⑥病毒感染致病毒性心肌?。?］。其中，異丙腎上腺素皮下注射誘導的心肌纖維化模型優勢在于方法簡單，無創且接近自然病程。大鼠皮下注射異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化文獻較多，小鼠相關的文獻較少，且異丙腎上腺素的給藥劑量、給藥間隔報道不一致［8］。本實驗對異丙腎上腺素的給藥劑量、給藥間隔進行了摸索，成功建立了小鼠的心肌纖維化模型。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級昆明種♂小鼠，22～25 g，由蘇州大學實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證：SCXK（蘇）2007-0007；實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2007-0035。實驗處置符合動物倫理學標準。

1.2 儀器與藥物 倒置顯微鏡XDS-1B型（重慶光學儀器廠）；722型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；DS-671電子秤（上海寺岡電子有限公司）；80-2型臺式低速離心機（上海醫療器械集團有限公司）；PK-S22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏儀器設備有限公司）；MR23i高速冷凍離心機（法國Jouan公司）；MyCycler TM型 PCR儀（美國 Bio-rad公司）。異丙腎上腺素購自上海禾豐制藥有限公司；Hydro試劑盒購自南京建成生物公司；CollagenⅠ引物購自上海生工科技公司。其余試劑為分析純。

1.3 模型制備 將昆明種小鼠隨機分為心肌纖維化模型組和溶媒對照組，每組10只。模型組小鼠皮下注射5 mg·kg-1異丙腎上腺素1 d后，以2.5 mg·kg-1維持至30 d。溶媒對照組同法皮下注射等量的生理鹽水。

1.4 心重指數（cardiac weight index，CW I）測定 末次注射異丙腎上腺素（對照組注射生理鹽水）后次日，2組小鼠稱重，頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠心臟，稱重，計算CWI。CWI（mg/g）＝全心重/體重。

1.5 小鼠心肌中羥脯氨酸（hydroxyproline，Hydro）含量測定 采用消化法檢測小鼠心肌中Hydro含量，組織中的膠原經酶消化產生Hydro，Hydro在氧化劑的作用下所產生的氧化產物，與二甲氨基苯甲醛作用呈現紫紅色，在550 nm測定Hydro含量，具體操作按照Hydro測定試劑盒?？捡R斯亮藍法測定總蛋白含量，具體操作按照總蛋白測定試劑盒進行。Hydro含量計算公式：

1.6 小鼠心室HE染色和M asson染色 小鼠心臟樣本在10%甲醛溶液中固定、石蠟包埋、切片，進行HE和Masson染色，觀察心肌纖維化的程度和膠原的含量，采用自動成像分析系統（Visilog 4.1.5，Noesis），計算心肌膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）。CVF為膠原的面積占總面積的比值。

1.7 CollagenⅠ mRNA測定 小鼠左心室勻漿后，用TRIzol提取總RNA，進行逆轉錄和PCR。CollagenⅠ的引物：上游 5′-ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC-3′，下游 5′-CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT-3′，擴增片段長度為169 bp，退火溫度為55℃。GAPDH的引物：上游 5′-GTATGACGTGGAGTCTACTG-3′，下游 5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-3′，擴增片段長度為728 bp，退火溫度為56℃。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，結果經凝膠掃描圖像處理系統分析，以CollagenⅠ基因擴增帶灰度與同管擴增的GAPDH基因擴增帶灰度之比表示CollagenⅠmRNA表達水平。

1.8 統計學處理 實驗數據以±s表示，顯著性檢驗采用one-way ANOVA。

2 結果

2.1 對CW I和小鼠心肌中Hydro含量的影響 皮下注射異丙腎上腺素后，模型組的CWI和Hydro含量均較溶媒對照組明顯增加（P＜0.01），見Fig 1和Fig 2。

Fig 1 Com parison of CW I from control group and model group（±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

Fig 2 Comparison of Hydro content in m yocardial tissues from control group and model group±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

2.2 小鼠心室HE和M asson染色結果 HE染色和Masson染色結果如Fig 3和Fig 4A所示，溶媒對照組心肌細胞排列整齊，形狀基本一致；模型組心肌細胞間可見有較多的纖維組織。CVF計算結果顯示，模型組較溶媒對照組明顯增加（P＜0.01），見 Fig 4B。

Fig 3 Com parison of histopathological changes ofm yocardial tissues from control group and model group（HE staining，400×）A：Control group；B：Model group

Fig 4 Comparison of histopathological changes ofmyocardial tissues from control group and model group by Masson staining（40×）a：Control group；b：Model group；B：CVF（xˉ±s，n＝10）.**P＜0.01 vs control group

2.3 心肌CollagenⅠ mRNA的表達 RT-PCR結果顯示，與對照組比較，模型組CollagenⅠmRNA表達明顯增加（P＜0.01），見 Fig 5。

Fig 5 Com parison of CollagenⅠm RNA expression in the left ventricle from control group and model group（xˉ±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

3 討論

異丙腎上腺素在誘導小鼠心肌纖維化的過程中，通過激活RAAS系統，明顯增加血漿中腎素、醛固酮和血管緊張素轉化酶（ACE）活性［9］，增加血漿中血管緊張素Ⅱ，而醛固酮通過鹽皮質受體增加心肌AT l受體水平［10］，進而血管緊張素Ⅱ通過激活ATl受體降低心肌成纖維細胞中膠原酶的活性［11］，最終增加心肌間質膠原的合成，促進心肌纖維化的發生發展［12-13］。

我們通過前期的預實驗和本研究發現，在用異丙腎上腺素制備小鼠心肌纖維化模型的過程中，異丙腎上腺素皮下注射的劑量、間隔時間和環境溫度是模型成功與否的3個關鍵因素。異丙腎上腺素是β受體激動劑，作用于心臟β1受體，使心肌收縮力增強、心率加快、心輸出量和心肌耗氧量增加。異丙腎上腺素皮下注射劑量過大，是導致小鼠死亡的直接原因。但是，若是皮下注射異丙腎上腺素劑量過小，小鼠通過自身代償機制，又不容易形成纖維化。因此，如何選擇一種合適的劑量，使小鼠容易形成心肌纖維化，又不致死，是該模型能否成功的關鍵因素之一。我們在預實驗的研究中，異丙腎上腺素首先從40 mg·kg-1初始劑量皮下注射開始摸索，結果發現，每次皮下注射后都會有不同數量的小鼠死亡，隨著給藥天數的增加，最后存活的小鼠所剩無幾。所以，我們逐漸降低異丙腎上腺素的給藥劑量，最后發現，首劑給予沖擊劑量5 mg·kg-1，后以2.5 mg·kg-1維持 30 d，每天同一時間注射1次，是小鼠不致死又能造成心肌纖維化模型的適當劑量和給藥間隔。心肌纖維化時，心肌組織中膠原纖維過量積聚，心肌膠原主要包括CollagenⅠ和CollagenⅢ，其中CollagenⅠ約占膠原總量的80%～85%，通過測定心肌組織Hydro含量來作為心肌纖維化的標志［14］（1 g Hydro相當于8.2 g膠原蛋白）［15］，肉眼可以觀察到心臟體積和重量的增加（用CWI表示）。實驗結果顯示，在該注射方案下，心肌纖維化模型組小鼠的CWI、Hydro含量以及CollagenⅠmRNA表達明顯增加，HE和Masson染色可更加直觀地看出模型組小鼠心肌組織中的膠原明顯增加，心肌細胞排列不整齊，心肌細胞間可見有較多的纖維組織。另外，環境溫度控制也非常關鍵，環境溫度過高，加快異丙腎上腺素的吸收，也容易導致小鼠的死亡，尤其是在天氣炎熱的季節，更應嚴格控制動物房內的環境溫度。一般將溫度控制在18～22℃之間為宜。

本研究通過皮下注射異丙腎上腺素成功制備了小鼠心肌纖維化模型，相比于其他造模的方法，該方法不需要開腹、開胸，損傷小，死亡率很低；用小鼠做實驗更加易于操作；同時，該方法制備的模型符合缺血性心肌損傷的病理進程，是制備心肌纖維化理想的動物模型，為心肌纖維化的研究提供了一種簡便、經濟、可靠的小鼠模型。

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