左卡尼汀調控鈣調神經磷酸酶表達抑制過氧化氫誘導心肌細胞凋亡作用

賈桂枝，王洪新，李 紅，王翠瑤，戴紅良

（遼寧醫學院1.生物化學與分子生物學教研室、2.藥理學教研室、3.護理學院，遼寧錦州 121001）

心肌缺血／再灌注可引起心肌細胞廣泛性的壞死，促發心力衰竭，是目前世界上引起人類死亡的最重要原因之一［1］。缺血／再灌注損傷在人體會引起心肌細胞產生過多的活性氧，發生氧化應激性的損傷。H2O2等活性氧能改變心肌細胞內凋亡相關蛋白的表達水平，最終引發細胞凋亡［2］。因此，對抗由氧化應激介導的心肌細胞凋亡對于臨床治療各種缺血性心臟病意義重大。鈣調神經磷酸酶（calcineurin，CaN）是目前已知唯一受鈣離子／鈣調素調節的蛋白磷酸酶類。在Ca2＋的激活下，對包括心肌細胞在內的多種細胞的凋亡進行調節［3－4］。有研究已證實缺血／再灌注損傷［5］、H2O2［6］及血清剝奪［7］等誘導的心肌細胞凋亡均與CaN有關。左卡尼汀是位于線粒體膜的機體內源性化合物，其主要作用是促進長鏈脂肪酸轉運至線粒體進行β氧化，為機體供能［8］。除此之外，左卡尼汀還具有明顯的抗氧化、抗凋亡活性［9－10］。其可通過緩解細胞內的Ca2＋超載，明顯抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡［10］。但左卡尼汀抗H2O2致心肌細胞凋亡的機制是否與CaN有關，仍缺乏相關報道。為此，本研究利用體外培養的新生大鼠心肌細胞，探討CaN在左卡尼汀抑制H2O2誘導心肌細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 左卡尼汀、環孢素A（cyclosporin A，CsA）、胰蛋白酶、達爾伯克必需基本培養基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM）低糖培養基均購于美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒美國Pierce公司；cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax一抗購于美國Cell Signaling公司；CaN一抗購自美國Santa Cruz公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗購于美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxide，HRP）標記的二抗購于美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗動物 出生1～3 d的Sprague-Dawley（SD）大鼠乳鼠，♀♂不拘，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。動物合格證號：SCXK（遼）2003-0007。

1.3 心肌細胞培養 新生大鼠心肌細胞原代培養方法，參照文獻［10］。取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，開胸取出心臟，用 D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的碎塊，在37℃條件下，以0.8 g·L－1胰蛋白酶消化分離細胞。將消化完畢的細胞以差速貼壁法進行純化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞貼壁融合后，換以含0.04%胎牛血清的DMEM，繼續培養24 h后，將細胞分組用于實驗。

1.4 實驗分組 在進行細胞凋亡及細胞內cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax表達水平分析的實驗中，將體外培養的SD大鼠心肌細胞隨機分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼汀（1.2 mmol·L－1） ＋H2O2組和 CsA（CaN特異性抑制劑，1μmol·L－1）＋H2O2組。在檢測細胞內CaN表達的實驗中將其分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼汀（1.2 mmol·L－1）組和左卡尼汀＋H2O2組。H2O2作用強度為200μmol·L－1、12 h刺激。左卡尼汀于加入H2O21 h前加入，CsA于加入 H2O230 min前加入［10－11］。左卡尼汀及 CsA均維持至 H2O2作用結束。

1.5 心肌細胞凋亡測定 將經過處理的心肌細胞用1.25 g·L－1胰蛋白酶消化分離，調節細胞密度為1×109·L－1后，上流式細胞儀進行檢測。具體操作方法按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進行。

1．6 Western blot 待各組細胞處理結束后，加細胞裂解液RIPA［（1%乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP-40），0.5% 脫氧膽酸鈉，1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），0.1%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）］提取細胞總蛋白，2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。取50μg總蛋白，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水煮5 min后置10%SDS-PAGE中進行電泳，待電泳完成后電轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，接著加cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、CaN及 GAPDH一抗 4℃孵育過夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP標記的二抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后，化學發光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。利用美國國立衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）Image J 1.42軟件對掃描的條帶進行灰度分析。指定對照組蛋白表達為1，以其它組與對照組的比值反映各組的相對蛋白表達。

1.7 統計學處理 數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數值以ˉx±s表示。組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2．1 左卡尼汀及CsA對心肌細胞凋亡的影響 Fig 1結果顯示，與對照組相比，H2O2處理組心肌細胞凋亡明顯增加。而左卡尼汀及CsA預處理能夠明顯降低H2O2誘導的心肌細胞凋亡。

Fig 1 Effect of L-carnitine and CsA on H 2O2-triggered apoptosis in rat cardiac myocytes（n＝4）

2．2 左卡尼汀及CsA對心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響 Fig 2結果顯示，與正常組比較，H2O2處理12 h后心肌細胞內cleaved caspase-3及Bax的表達明顯增加，而Bcl-2的表達卻明顯降低。左卡尼汀及CsA均能明顯地改善H2O2誘導的上述改變。

2．3 左卡尼汀對心肌細胞內CaN表達水平的影響Fig 3結果顯示，與正常組比較，H2O2處理12 h后心肌細胞內CaN表達水平明顯增加。左卡尼汀能明顯降低H2O2處理組心肌細胞CaN的表達。而其本身不影響CaN的表達。

3 討論

本實驗發現，左卡尼汀可通過抑制CaN的過表達以抑制氧化應激狀態下心肌細胞凋亡的發生。

目前越來越多的研究提示缺血／再灌注損傷與心肌細胞凋亡有著密切的關系。盡管缺血／再灌注引起凋亡的確切機制尚未完全闡明，但可以肯定其與氧化應激損傷、鈣超載有關［12－13］。H2O2可誘發心肌細胞內的鈣超載，引起心肌凋亡。而左卡尼汀能夠明顯地緩解鈣超載，抑制其細胞的凋亡［10］。CaN是細胞內鈣離子執行功能的重要靶蛋白之一。最近的研究發現，CaN在H2O2誘導的心肌凋亡中發揮著重要作用［6］。本實驗也發現，在CaN經其特異性抑制劑CsA阻斷后，H2O2所誘發的各種凋亡相關蛋白的表達得到明顯改善。具體表現為促凋亡蛋白cleaved caspase-3及Bax的表達下調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調。心肌細胞的凋亡也明顯降低。而更為重要的是，左卡尼汀在抑制心肌細胞凋亡的同時，能夠明顯降低H2O2誘導下CaN的過表達，提示左卡尼汀的抗凋亡活性可能與其抑制CaN的過表達有關。

關于CaN誘導心肌細胞凋亡的機制，可能涉及以下幾個方面：① 與細胞凋亡信號調節激酶（ASK1）相互作用［14］；② 影響 Bad的磷酸化，拮抗Bcl-2家族抗凋亡作用［15］；③去磷酸化（活化）轉錄因子活化T細胞核因子3（nuclear factor of activated T cells 3，NFATc3），使其由胞質轉位于胞核，介導凋亡相關基因的表達［16］。而左卡尼汀抗心肌細胞凋亡的作用是否也涉及上述機制，仍有待于進一步的實驗論證。

總之，本研究證實左卡尼汀對H2O2誘發心肌細胞凋亡具有明顯的抑制作用，其作用機制可能與調控CaN的表達有關。該發現為左卡尼汀的臨床應用提供了實驗依據。

Fig 2 Effect of L-carnitine and CsA on apoptosis associated protein expression in rat cardiac myocytes（n＝3）

Fig 3 Effect of L-carnitine on H 2 O2-triggered CaN overexpression in rat cardiac myocytes（n＝3）

參考文獻：

［1］Yellon D M，Hausenloy D J.Myocardial reperfusion injury［J］.N Engl J Med，2007，357（11）：1121－35.

［2］羅元一，殷 明，鄔亞華，等.綠原酸對過氧化氫誘導大鼠髓核細胞凋亡保護作用的研究［J］.中成藥，2013，（4）：656－60.

［2］Luo Y Y，Yin M，Wu Y H，et al.Protective effects of chlorogenic acid against hydrogen peroxide induced rat nucleus pulposus cells apoptosis［J］.Chin Tradit Patent Med，2013，（4）：656－60.

［3］Lotem J，Kama R，Sachs L.Suppression or induction of apoptosis by opposing pathways downstream from calcium-activate calcineurin［J］.PNAS，1999，96（21）：12016－20.

［4］Molkentin J D.Calcineurin，mitochondrial membrane potential，and cardiomyocyte apoptosis［J］.Circ Res，2001，88（12）：1220－2.

［5］李文霞，沈小梅，陳 俠，等.鈣調磷酸酶在老齡大鼠心肌缺血／再灌注損傷所致細胞凋亡中的作用［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7（9）；1067－9.

［5］Li W X，Shen X M，Chen X，et al.The role of calcineurion in cell apoptosis during myocardial ischemia-reperfusion in aged rats［J］.Chin J Integr Med Cardio Cerebrovascul Dis，2009，7（9）：1067－9.

［6］馮 星，金明華，劉曉梅，等.CaN抑制劑對H2O2誘導的大鼠H9c2心肌細胞凋亡的影響 ［J］.吉林大學學報（醫學版），2009，35（02）：249－53.

［6］Feng X，Jin M H，Liu X M，et al.Effect of inhibitor of calcineurin on myocardial H9c2 cell apoptosis induced by H2O2［J］.J Jilin Univ：Med Ed，2009，35（02）：249－53.

［7］González-Juanatey J R，Pi?eiro R，Iglesias M J，et al.GH prevents apoptosis in cardiomyocytes cultured in vitro through a calcineurin-dependent mechanism［J］.J Endocrinol，2004，180（2）：325－35.

［8］Rebouche CJ，Seim H.Carnitine metabolism and its regulation in microorganisms and mammals［J］.Annu Rev Nut，1998，18：39－61.

［9］戴紅良，王洪新，吳國強，等.左卡尼汀對心肌細胞H2O2損傷的保護作用［J］.遼寧醫學院學報，2009，30（01）：4－6.

［9］Dai H L，Wang H X，Wu GQ，et al.Protective effect of L-carnitine on H2O2-induced damages in cardiomyocytes［J］.J Liaoning Med Univ，2009，30（01）：4－6.

［10］梁春光，戴紅良，黃 雷，等.左卡尼汀對過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡的抑制作用（英文）［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2012，26（5）：602－9.

［10］Liang CG，Dai H L，Huang L，et al.Inhibitory effect of L-carnitine on cardiomyocyte apoptosis induced by hydrogen peroxide［J］.Chin J Pharmacol Toxicol，2012，26（5）：602－9.

［11］趙素玲，王洪新，周振華，等.黃芪多糖對異丙腎上腺素誘導的乳大鼠心肌細胞肥大的保護作用［J］.中國藥理學通報，2011，27（12）；1682－6.

［11］Zhao SL，Wang H X，Zhou Z H，et al.Protective effects of Astragalus polysaccharides on isoproterenol induced myocardial hypertrophy in neonatal rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（12）：1682－6.

［12］Davies K J，Lin S W.Degradation of oxidatively denatured proteins in Escherichia coli［J］.Free Radic Biol Med，1988，5（4）：215－23.

［13］Ermak G，Davies K J.Calcium and oxidative stress：from cell signaling to cell death［J］.Mol Immunol，2002，38（10）：713－21.

［14］Liu Q，Wilkins B J，Lee Y J，et al.Direct interaction and reciprocal regulation between ASK1 and calcineurin-NFAT control cardiomyocyte death and growth［J］.Mol Cell Biol，2006，26（10）：3785－97.

［15］Feske S，Okamura H，Hogan P G，et al.Ca2＋／calcineurin signalling in cells of the immune system［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，311（4）：1117－32.

［16］Zhu H，Gao W，Jiang H，et al.Calcineurin mediates acetylcholinesterase expression during calcium ionophore A23187-induced HeLa cell apoptosis［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773（4）：593－602.