脈絡寧對肢體缺血／再灌注兔骨骼肌iNOS mRNA及eNOS mRNA表達的影響

王岱君，田 華

（濰坊醫(yī)學院1.山東省重點學科人體解剖與組織胚胎學實驗室，2.校醫(yī)院，山東 濰坊 261053）

肢體缺血／再灌注損傷常見于骨外科、創(chuàng)傷外科、血管外科等，其后果是通過一系列病理生理反應，最終導致組織細胞的損傷乃至壞死。

國內(nèi)外學者對缺血／再灌注損傷進行了長時間大量的研究，但這些研究主要集中于心、腦、腎、肝等組織器官［1－5］。脈絡寧注射液是一種中藥制劑，廣泛應用于心腦血管病的治療。我們前期工作發(fā)現(xiàn)脈絡寧注射液具有保護肢體缺血／再灌注損傷的作用［6－7］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，采用原位分子雜交方法檢測骨骼肌誘導型一氧化氮合酶mRNA（iNOS mRNA）及內(nèi)皮型一氧化氮合酶mRNA（eNOS mRNA）表達，進一步探討脈絡寧注射液對缺血／再灌注骨骼肌的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所用動物為清潔級健康成年♂新西蘭大耳白兔，共30只，體質(zhì)量（2.0～2.5）kg，平均 2.2 kg，由山東大學實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境為室溫25℃，濕度40%～60%。普通飼料喂養(yǎng)，正常飲水。

1.2 主要試劑與儀器 脈絡寧注射液由金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠生產(chǎn)，批號：20111030，10 ml／支；iNOS mRNA、eNOSmRNA原位分子雜交試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；TDZ5-WS離心機由長沙湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn)；MetaMorph／DP10／BX41顯微圖像分析系統(tǒng)由 UIC／OLYMPUS，US／JP生產(chǎn)。

1.3 動物分組及模型建立 30只動物隨機分為3組：假手術(shù)組（Sham），缺血／再灌注組（I／R）和脈絡寧組（Mailuoning），每組10只，實驗前12 h禁食。參照 Nanobashvili等［8］的方法建立兔后肢缺血／再灌注動物模型。30只動物皆自耳緣靜脈注射體積分數(shù)為0.20的烏拉坦5 ml·kg－1進行麻醉，右腹股溝區(qū)小心剪毛，勿傷及皮膚，消毒，鋪蓋無菌洞巾，沿股血管神經(jīng)走行方向切開皮膚，在解剖顯微鏡下分離暴露股動、靜脈及股神經(jīng)。缺血／再灌注組與脈絡寧組動物用微血管夾夾閉股動脈，在后肢近側(cè)端用橡皮止血帶進行環(huán)扎阻斷側(cè)枝循環(huán)，以保證右后肢血液完全斷流。2 h后除去血管夾及橡皮止血帶，恢復血供。假手術(shù)組動物只切開腹股溝處皮膚暴露股血管，不進行夾閉股動脈及環(huán)扎后肢。

在缺血后2 h，即肢體即將恢復血供時，脈絡寧組各動物靜脈注射脈絡寧注射液1.5 ml·kg－1，其他兩組每只動物分別注射等體積的生理鹽水。

1.4 取材及樣品制備 再灌注后4、8、12和24 h，各組分別自術(shù)側(cè)脛骨前肌切取約2 cm×1 cm×0.5 cm大小的骨骼肌組織，置于含有1／1 000 DEPC的0.4%多聚甲醛溶液中固定，用于iNOSmRNA、eNOSmRNA表達的檢測。

1．5 骨骼肌iNOSmRNA及eNOSmRNA檢測 將固定的骨骼肌標本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片。同一張載玻片上貼2張切片，分別用于檢測iNOSmRNA和eNOSmRNA。原位雜交具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，棕黃色為陽性雜交信號。顯微圖像分析系統(tǒng)對陽性染色進行分析，雜交信號的強弱以平均光密度表示。

1.6 統(tǒng)計學分析 所得數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，應用SPSS 16.0 for Windows統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。多組樣本均數(shù)比較行單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較用Newman-Keuls檢驗（q檢驗）。

2 結(jié)果

2．1 骨骼肌iNOS mRNA表達 假手術(shù)組在各時間點iNOSmRNA皆有少量表達，各時間點比較無差異（P＞0.05）。缺血／再灌注組iNOSmRNA表達自再灌注后2 h開始逐漸增高，至8 h達高峰，之后逐漸下降，再灌注后8 h與其他時間點比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），各時間點與假手術(shù)組同時間點比較均明顯增高（P＜0.01或P＜0.05）。脈絡寧組iNOSmRNA表達與缺血／再灌注組同時間點比較明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），與假手術(shù)組同時間點比較，除再灌注后8 h外，無統(tǒng)計學意義。見Tab 1。

Tab 1 Comparison of iNOS mRNA expression among groups（ˉx±s，n＝10）

2．2 骨骼肌eNOS mRNA表達 假手術(shù)組在各時間點皆有eNOSmRNA表達。缺血／再灌注組在各時間點表達與假手術(shù)組同時間點比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），脈絡寧組再灌注后各時間點表達與缺血／再灌注組同時間點比較明顯增高（P＜0.01或P＜0.05）。見Tab 2。

Tab 2 Comparison of eNOS mRNA expression among groups（ˉx±s，n＝10）

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，肢體缺血／再灌注后骨骼肌組織內(nèi)iNOSmRNA表達水平明顯上調(diào)。肢體缺血／再灌注后可產(chǎn)生釋放大量活性氧物質(zhì)和炎癥介質(zhì)，組織內(nèi)過氧化反應明顯增強，從而誘生并活化骨骼肌細胞內(nèi)的iNOS，而使組織中NO生成增多，介導缺血／再灌注損傷。研究結(jié)果顯示，iNOSmRNA在再灌注后2 h表達明顯升高，在再灌注后8 h達高峰，表明肢體缺血／再灌注后的2 h～8 h內(nèi)有大量刺激因子產(chǎn)生。再灌注8 h后，iNOSmRNA表達水平呈現(xiàn)下降趨勢，可能是缺血／再灌注產(chǎn)生釋放的刺激因子在再灌注8 h后逐漸減少，或是隨病程的發(fā)展，組織細胞因損傷而致基因轉(zhuǎn)錄下降，也可能是誘導產(chǎn)生的大量NO對iNOS基因表達具有負反饋調(diào)節(jié)作用。應用脈絡寧后iNOS mRNA明顯降低，表明脈絡寧能夠抑制缺血／再灌注后iNOSmRNA表達的上調(diào)，從而抑制由其誘生的高水平NO而介導組織損傷。

關(guān)于缺血／再灌注后eNOSmRNA以及蛋白的表達是增強還是降低，觀點不一。多數(shù)學者認為，缺血／再灌注后內(nèi)皮損傷導致內(nèi)皮機能障礙，eNOS mRNA表達降低。但也有學者認為，缺血／再灌注后eNOS mRNA及蛋白的表達并無明顯降低［9］，甚至可使表達增強［4］。我們的研究顯示，缺血／再灌注組在各時間點eNOS mRNA表達與假手術(shù)組比較均無明顯變化，這與第二種觀點基本一致。應用脈絡寧后eNOSmRNA的表達明顯增高，可能是在缺血／再灌注過程中脈絡寧能夠上調(diào)eNOS mRNA表達，發(fā)揮保護內(nèi)皮功能、減少黏附分子表達和阻止中性粒細胞遷移等作用。

綜上所述，本實驗是從基因水平對肢體缺血／再灌注后iNOSmRNA及eNOSmRNA的表達及脈絡寧對其表達的影響進行了研究，結(jié)果表明缺血／再灌注過程中iNOSmRNA表達增強，脈絡寧可下調(diào)再灌注過程中iNOSmRNA表達，上調(diào)eNOSmRNA表達，對肢體缺血／再灌注損傷具有保護作用。但本實驗只是從mRNA的表達進行了研究，未能結(jié)合iNOS、eNOS的蛋白表達進行對比研究是其不足，今后尚需進一步探索。

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