水體銅脅迫對克氏原螯蝦血淋巴ROS和血藍蛋白含量的影響

趙輝　魏克強

摘 要：在測得Cu2+致克氏原螯蝦96 h LC50的質量分數為30 mg/L的基礎上，將螯蝦分別暴露于質量分數為0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L的Cu2+溶液中，在暴露24 h、48 h、72 h和96 h后，測定血淋巴ROS和血藍蛋白含量。結果表明，螯蝦血淋巴ROS含量呈現先被誘導上升后被抑制的趨勢，Cu2+具有能夠抑制螯蝦血淋巴細胞產生活性氧ROS的能力；血清血藍蛋白含量先上升而后逐漸趨于穩定，最后顯著上升。

關鍵詞：銅離子（Cu2+）；克氏原螯蝦；ROS；血藍蛋白

中圖分類號：X174 文獻標識碼：A 文章編號：2095-6835（2014）04-0103-02

甲殼動物的免疫防御為非特異性免疫，缺乏高等動植物的特異性免疫功能，利用活性氧作為殺傷分子的氧化性殺菌機制是甲殼動物一種主要的防御機制，它主要指吞噬細胞在吞噬異物或者受刺激活化呼吸爆發產生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），這個過程就是呼吸爆發。研究表明，機體活性氧產生的強弱程度直接反映了血細胞殺菌功能的強弱。血藍蛋白是生物體內的一種多功能蛋白，甲殼動物血藍蛋白約占血淋巴蛋白的90%以上。作為一種呼吸蛋白，血藍蛋白除載氧外還具有酚氧化物酶活性、抗菌肽活性和凝集活性等功能，此外血藍蛋白還具有轉運金屬離子、能量儲存等功能。

本實驗以克氏原螯蝦為研究對象，測定了Cu2+脅迫下螯蝦血細胞呼吸爆發后血淋巴ROS含量和血淋巴血藍蛋白含量的變化，探討Cu2+對克氏原螯蝦血淋巴ROS和血藍蛋白含量的影響，從而為水產品的安全養殖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），購于太原市五龍口水產批發市場，體重（20.1±0.5）g，體長（8.7±0.3）cm。實驗前在40 cm×30 cm×20 cm 的玻璃水族箱中馴養1周，馴養水為曝氣2 d以上的自來水，每天不間斷曝氣，每天投放飼料1次，定時換水，實驗前1 d停止喂食。

Cu2+溶液用硫酸銅配制（CuSO4·5H2O，分析純，天津市登峰化學試劑廠），實驗前用蒸餾水將CuSO4·5H2O配成質量濃度為10 g/L的母液備用。二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購于sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 染毒方法

根據急性毒性實驗結果，Cu2+致克氏原螯蝦96 h LC50的質量濃度為30 mg/L，實驗設5個質量濃度梯度組（質量濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L）和一個對照組（質量濃度為0 mg/L），處理時間為96 h。采用體外暴露的方法對克氏原螯蝦進行Cu2+染毒，每個處理組15只。整個試驗階段停止喂食，水溫14～16 ℃。

1.3 采樣及樣品處理

暴露24 h、48 h、72 h、96 h后分別從對照組和處理組中隨機取出3尾螯蝦，采集血淋巴，用1 mL注射器從螯蝦圍心腔采血，制成抗凝血（抗凝劑∶血=1∶1），其中一部分用于血淋巴ROS含量的測定，另一部分抗凝血制備成血清，在溫度為4 ℃的條件下，5 000 r/ min離心10 min，取出的上清液于-20 ℃的條件下保存，用于血藍蛋白的測定。

1.4 血淋巴ROS含量測定

血淋巴ROS的測定按照細胞活性氧（ROS）試劑盒說明書進行，組織ROS利用DCFH-DA熒光探針進行檢測，取抗凝血190 μL和10 μL物質的量濃度為0.1 mmol/L的DCFH-DA溶液加入96孔黑色酶標板中，混勻，置于酶標儀中37 ℃保溫。30 min后于激發波長485 nm，在發射波長538 nm的條件下檢測熒光強度，結果以突光強度/毫克蛋白表示。

1.5 血清血藍蛋白含量測定

2 結果與分析

2.1 不同濃度Cu2+暴露對螯蝦血淋巴ROS含量的影響

不同濃度Cu2+脅迫下螯蝦血淋巴ROS含量隨時間的變化如圖1所示，經硫酸銅處理24 h后，Cu2+質量濃度為3.0 mg/L時，ROS含量達到最大值。與對照組相比極顯著升高（P<0.01），Cu2+質量濃度為5.0 mg/L，與對照組相比ROS含量顯著升高（P<0.05），其余處理組與對照組相比無顯著差異；銅暴露48 h、72 h和96 h后，隨著Cu2+質量濃度的升高，ROS含量逐漸下降。銅暴露48 h后，Cu2+質量濃度為1.0 mg/L和10.0 mg/L，ROS含量與對照組相比極顯著降低（P<0.01），質量濃度為0.5 mg/L的處理組ROS含量與對照組相比顯著降低（P<0.05），其余處理組與對照組相比無顯著差異。銅暴露72 h后，當Cu2+質量濃度為0.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L時，ROS含量與對照組相比顯著降低（P<0.05），其余處理組與對照組相比無顯著差異。銅暴露96 h后，各處理組ROS含量均低于對照組，但與對照組相比無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

3.1 Cu2+脅迫對螯蝦血淋巴ROS含量的影響

重金屬等環境污染物進入生物體內，能夠引起機體一系列的生理生化反應，對于沒有特異性免疫功能的甲殼動物來說，吞噬作用在機體的防御機制中起著舉足輕重的作用。血細胞吞噬作用的主要機制之一就是伴隨著呼吸爆發產生大量的活性氧ROS，從而導致機體的氧化損傷。實驗結果表明，在Cu2+暴露24 h后，螯蝦血淋巴ROS含量顯著升高，3.0 mg/L的處理組表現為極顯著升高。48～72 h期間，所有處理組的ROS含量均顯著下降，低于對照組的含量。染毒96 h后，螯蝦血淋巴ROS含量逐漸趨于穩定，各處理組ROS含量低于對照組，但與對照組相比無顯著差異。王寶杰等的研究明，Cu2+對對蝦血細胞產生活性氧ROS的能力具有不同程度的抑制作用，這與本實驗研究結果相符。張峰等的研究表明，重金屬能夠抑制皺紋盤鮑血細胞吞噬活動中的活性氧（ROS）的產生，而且這種抑制作用隨著重金屬濃度的增加而加強。

3.2 Cu2+脅迫對螯蝦血清血藍蛋白含量的影響

血藍蛋白是甲殼動物血淋巴中一種含銅的呼吸蛋白，脫氧狀態為無色，結合氧狀態為藍色，其含量容易受到各種因素的影響，比如溫度、pH值、機體狀態和其他環境因子等。Cu2+暴露24 h后，各處理組的血藍蛋白含量均高于對照組；暴露48 h時，各組的血藍蛋白含量趨于穩定，暴露72 h和96 h后，血藍蛋白含量顯著上升。張亞娟等研究表明，日本沼蝦在受到環境因素的脅迫后，血藍蛋白含量顯著升高，與本實驗得出的結果一致。中華絨鰲蟹在從淡水過渡到咸水中時，血藍蛋白的含量也會發生顯著的變化。

參考文獻

[1]孫敬鋒，吳信忠.貝類血細胞及其免疫功能研究進展[J].水生生物學報，2006，30（5）：601-607.

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[6]王寶杰，王雷.中國對蝦血細胞吞噬活動中超氧陰離子的產生[J].中國水產科學，2003，10（1）：14-18.

[7]張峰，李光友.幾種重金屬對皺紋盤鮑血細活性氧產生的影響[J].海洋環境科學，2005，24（1）：32-34.

[8]張亞娟，劉存歧，王軍霞，等.氨態氮和亞硝態氮對日本沼蝦血細胞數量及血藍蛋白含量的影響[J].四川動物，2008，27（5）：853-854.

[9]王順昌，許立.不同鹽度下中華絨鰲蟹血清總蛋白和血藍蛋白含量的變化[J].淮南師范學院學報，2003，5（19）：24-26.

〔編輯：陳文強〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin

3.2 Cu2+脅迫對螯蝦血清血藍蛋白含量的影響

血藍蛋白是甲殼動物血淋巴中一種含銅的呼吸蛋白，脫氧狀態為無色，結合氧狀態為藍色，其含量容易受到各種因素的影響，比如溫度、pH值、機體狀態和其他環境因子等。Cu2+暴露24 h后，各處理組的血藍蛋白含量均高于對照組；暴露48 h時，各組的血藍蛋白含量趨于穩定，暴露72 h和96 h后，血藍蛋白含量顯著上升。張亞娟等研究表明，日本沼蝦在受到環境因素的脅迫后，血藍蛋白含量顯著升高，與本實驗得出的結果一致。中華絨鰲蟹在從淡水過渡到咸水中時，血藍蛋白的含量也會發生顯著的變化。

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[9]王順昌，許立.不同鹽度下中華絨鰲蟹血清總蛋白和血藍蛋白含量的變化[J].淮南師范學院學報，2003，5（19）：24-26.

〔編輯：陳文強〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin

3.2 Cu2+脅迫對螯蝦血清血藍蛋白含量的影響

血藍蛋白是甲殼動物血淋巴中一種含銅的呼吸蛋白，脫氧狀態為無色，結合氧狀態為藍色，其含量容易受到各種因素的影響，比如溫度、pH值、機體狀態和其他環境因子等。Cu2+暴露24 h后，各處理組的血藍蛋白含量均高于對照組；暴露48 h時，各組的血藍蛋白含量趨于穩定，暴露72 h和96 h后，血藍蛋白含量顯著上升。張亞娟等研究表明，日本沼蝦在受到環境因素的脅迫后，血藍蛋白含量顯著升高，與本實驗得出的結果一致。中華絨鰲蟹在從淡水過渡到咸水中時，血藍蛋白的含量也會發生顯著的變化。

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[9]王順昌，許立.不同鹽度下中華絨鰲蟹血清總蛋白和血藍蛋白含量的變化[J].淮南師范學院學報，2003，5（19）：24-26.

〔編輯：陳文強〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin