莫西沙星聯合頭孢哌酮／舒巴坦對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌防耐藥突變濃度的研究

張欣悅，孫成春，公衍文，楊傳偉，劉 穎

（1.遼寧醫學院研究生院，遼寧錦州121001；2.濟南軍區總醫院藥劑科，山東濟南 250031；3.濟南軍區總醫院實驗診斷科，山東 濟南 250031；4.山東明仁福瑞達制藥股份有限公司研發部，山東 濟南 250104；5.天津藥物研究院，天津 300100）

鮑曼不動桿菌為非發酵革蘭陰性桿菌，主要引起呼吸道感染、敗血癥、泌尿系統感染、繼發性腦膜炎等。近年來研究表明，鮑曼不動桿菌在醫院感染中占第4位，已成為醫院感染的重要病原菌，并有逐年升高的趨勢［1］。由于碳青霉烯類藥物治療鮑曼不動桿菌感染的療效較好，在醫院感染的治療中被廣泛使用，使得耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）越來越多，給臨床治療帶來很大困難，已引起臨床和微生物學者的嚴重關注［2］。

Drlica等［3］提出的防突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）理論，為有效抑制細菌耐藥及制定應對策略提供了新的思路和參考依據。該理論是指最低抑菌濃度（MIC）到 MPC之間的范圍。MPC是防止耐藥突變菌株被選擇性富集擴增所需的最低抗菌濃度，也是評價抗菌藥物防耐藥能力的新指標。基于該理論，當兩種或以上藥物聯合應用時，細菌需要同時突變兩次或多次才能產生突變菌株，但這種概率非常低，從而使MSW縮小或關閉。目前關于MFX聯合CFS對CRAB的MPC的影響研究尚未見報道。本研究通過體外MFX聯合CFS對CRAB的MPC影響，探討抗菌藥物聯用降低MPC、縮小MSW的規律，為臨床合理使用有限的抗菌藥物、防止突變菌株的出現提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 抗菌藥物與培養基 莫西沙星（0.4 g／片，拜耳醫藥保健有限公司）；頭孢哌酮（cefoperazone，批號：30420-200304，含量：96.5%）、舒巴坦（sulbactam，批號：30430-200305，含量：89.2%）均購自中國藥品生物制品檢定所。M-H肉湯粉和M-H瓊脂平板培養基均購自英國Oxiod公司。

1.2 菌株來源與鑒定 選擇我院2010年1月～2012年8月臨床標本中分離的20株CRAB。質控菌為銅綠假單胞菌ATCC27853。經VITEK-2分析儀鑒定，采用紙片擴散法（Kirby-Bauer法）進行藥敏試驗，選取對亞胺培南或美羅培南耐藥的鮑曼不動桿菌20株。

1.3 實驗儀器 電熱恒溫培養箱（山東濰坊精鷹醫療器械有限公司）；Vitek比濁儀、VITEK-2全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）；XK 96-3型微量振蕩器（姜堰市新康醫療器械有限公司）；-80℃超低溫冰箱（SANYO Electric Co.Ltd.）。

1.4 最低抑菌濃度的測定

1.4.1 測定單獨應用時的MIC 采用微量肉湯稀釋法測定MFX和CFS分別使用時的MIC，并按美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2012年標準［4］判斷結果。

1.4.2 測定MFX和CFS聯合應用時的MIC 采用簡化棋盤法［5］測定MFX和CFS聯用時的MIC。

1.4.3 計算部分抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，FIC）指數及判定標準 FIC指數 ＝MIC甲藥聯用／MIC甲藥單用+MIC乙藥聯用／MIC乙藥單用。判定標準：FIC指數≤0.5，協同作用；0.5～1，相加作用；1～2，無關作用；FIC＞2，拮抗作用。

1.5 防耐藥突變濃度（MPC）的測定［6-7］

1.5.1 含單藥瓊脂平板的配制 采用瓊脂平板倍比稀釋法測定抗菌藥物對20株CRAB的 MPC。MFX和CFS的藥物濃度范圍分別為0.125～512 mg·L-1和2～512 mg·L-1。每個濃度配制4個平板作為平行對照。

1.5.2 含兩藥瓊脂平板的配制 以MFX和CFS的MIC、MPC為基準，采用二倍稀釋法配制含MFX與CFS混合的系列不同濃度梯度瓊脂平板。最低濃度為MFX和CFS的單藥MIC，最高濃度為MFX和CFS的單藥MPC，每個濃度4個平板。

1.5.3 菌懸液制備 從新鮮過夜培養的細菌平板上挑取單個菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃震蕩過夜培養，3 000 r·min-1離心后棄上清，再懸浮在200 ml MH肉湯中，震蕩培養6 h，3 000 r·min-1離心，棄上清，調整菌液濃度為3×1013CFU·L-1。

1.5.4 MPC的測定 取100μl 3×1013CFU·L-1菌液均勻涂布于含不同濃度藥物的MH平板上，每個濃度4個平板。（35±2）℃培養72 h，以4個平板均無細菌生長的最低藥物濃度為MPC。對含單藥瓊脂平板的測定為單藥MPC，對含兩藥瓊脂平板的測定即為聯合用藥后的MPC。對接近MPC藥物濃度篩選出來的菌株接種于無藥物的MH平皿，傳代兩次后，再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確定其是耐藥突變株。以上實驗重復兩次，取其平均值。

1.6 統計學分析 采用SPSS 16.0統計軟件對相關數據進行配對秩和檢驗分析。

Tab 1 Accumulative inhibitory rate of MIC（mg·L-1）for 2 antimicrobial agents against 20 strains of CRAB

2 結果

2.1 抗菌藥物對20株CRAB的MIC值 MFX和CFS對20株CRAB的MIC范圍分別為：0.125～2 mg·L-1、8～32 mg·L-1，見 Tab 1。

2.2 聯合藥敏 MFX與CFS聯用后，協同作用所占的比例為0.45（9／20），相加所占的比例為0.35（7／20），無關作用所占的比例為 0.20（4／20），未見拮抗作用，以協同和相加作用為主。

2.3 抗菌藥物單用及聯合使用對CRAB的MPC和SI值 MFX、CFS單用對20株CRAB的MPC范圍分別為4～64 mg·L-1、128～256 mg·L-1；MFX、CFS聯合使用后，兩者對20株CRAB的MPC范圍分別為：0.5～4 mg·L-1、64～128 mg·L-1。MFX、CFS單用對20株CRAB的選擇指數（selectiveity index，SI＝MPC／MIC）分別為：4～128、8～64；MFX、CFS聯合使用后兩者對20株CRAB的SI分別為：1～8、4～16，見 Tab 2。

3 討論

鮑曼不動桿菌是一種臨床常見和重要的醫院感染病原菌。近年來，隨著臨床治療中碳青霉烯類抗生素濫用現象的日益普遍，該菌對此類藥物的耐藥性明顯增強［8］，已成為當今醫院感染最為棘手的問題之一。

目前臨床應用的MIC給藥策略，在抑制或殺滅敏感菌的同時，使耐藥突變菌得到富集擴增，導致治療失敗。MSW理論［9］表明：當藥物濃度高于 MPC時，病原菌必須突變兩次或更多次才能生存，而這種突變的概率非常低。豆梅琴等［10］通過測定氟喹諾酮類抗菌藥物的MPC，認為當其濃度高于MPC時，可有效防止鮑曼不動桿菌耐藥突變體的產生。這與本文MFX單用所測MPC相吻合。結合文獻［11］報道的MFX最大血藥濃度 Cmax（4.5 mg·L-1），本試驗表明：單用MFX，藥物濃度往往落在MSW內，易產生耐藥。若要增大MFX的給藥劑量，可能會給患者帶來更嚴重的風險，可見單用MFX并不能產生理想療效。

MSW理論表明：當兩種不同作用機制的抗菌藥物聯合應用，并同時處于各自的MIC以上時，細菌很難同時產生兩種耐藥突變，使其MSW關閉或縮小，從而達到防止耐藥菌產生及減少不良反應的目的。Cai等［12］報道了多粘菌素聯合左氧氟沙星或妥布霉素可縮小其對多耐藥鮑曼不動桿菌的MSW，防止對多粘菌素耐藥的菌株出現。本研究的體外聯合藥敏結果顯示，MFX聯合CFS主要表現為協同和相加作用，無拮抗作用。因此兩藥聯用，可增強抑菌效果。結合藥代動力學參數分析，MFX單用時，其MPC大部分高于Cmax，聯合CFS后，MPC明顯降低到Cmax以下，有效的限制了耐藥菌株的產生；對于CFS，頭孢哌酮和舒巴坦的平均血清峰濃度分別為236.8 mg·L-1和130.2 mg·L-1。同 MFX一樣，聯合使用后，CFS的MPC降到Cmax以下。可見，將臨床常用的MFX和CFS聯合后，各自MPC明顯降低，使其藥物濃度高于MPC，進而有效防止耐藥菌株的產生；該實驗還表明，將MFX與CFS聯合使用，SI較其單用均有明顯下降。再次證實了聯用不同作用機制的抗菌藥物可減少耐藥菌的產生，獲得良好的療效。

本研究對MFX聯合CFS在治療CRAB感染方面進行了初步探討，為臨床合理使用現有抗菌藥物、防止耐藥菌產生提供了一定的理論指導和支持。由于體內藥物濃度不斷變化，影響因素復雜，聯合用藥時的藥代動力學相關參數與耐藥突變體富集的關系仍需進行相關的體內研究。

（致謝：本文在統計方面得到了濟南軍區總醫院于莉莉博士的指導和幫助，在此一并感謝！）

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