香菇多糖對小鼠T淋巴細胞膜上離子通道基因表達的影響

劉國欣，邢建國，李明春，付青姐，張彬（1.石河子大學藥學院，新疆 石河子 8000；.新疆維吾爾自治區藥物研究所，烏魯木齊 80000；.解放軍第401醫院，山東 青島 66000）

T淋巴細胞是生物體內最重要的免疫活性細胞之一，主行細胞免疫應答，并參與體液免疫應答，在人體的免疫系統功能中發揮著重要作用。T淋巴細胞膜上主要有電壓門控鉀離子通道（KV1.3）、Ca2+激活的鉀離子通道（KCa3.1）、陽離子通道（TRPM7）、氯離子通道（Clswell）4種離子通道[1]以及鈣離子通道（CRAC）激活的調控元件[基質相互作用因子（STIM）1和組成分子orai1]，這些離子通道的活動與離子跨膜運動、膜電位變化以及T淋巴細胞活化、增殖密切相關。KV1.3受膜電位控制，主要維持T淋巴細胞的靜息膜電位，它功能異常時，靜息電位降低，可抑制Ca2+進入細胞，故它可以通過影響Ca2+濃度來影響T淋巴細胞的激活與功能，此外還參與T淋巴細胞的體積調節過程。KCa3.1受細胞內Ca2+濃度調節，細胞內Ca2+濃度升高是KCa3.1開放的主要原因，它在T淋巴細胞的活化過程中具有重要的作用[2]。T淋巴細胞上CRAC是細胞外Ca2+進入細胞的唯一通路，它通過調控細胞內Ca2+濃度來調控T淋巴細胞的活動[1]。TRPM7是一種非選擇性的陽離子通道，對Ca2+、Mg2+、K+、Na+在內的眾多陽離子有通透性[3]，同時作為一種蛋白激酶可使自身或底物磷酸化[4]。Clswell是T淋巴細胞上的Cl－通道，正常狀態下不開放，當細胞體積增大時，激活Clswell通道，Cl－由細胞內流向細胞外，直至細胞體積恢復至原來體積時Clswell通道關閉[1]。總之，T淋巴細胞膜上的離子通道作為T淋巴細胞內信號轉導的一條重要途徑，在T淋巴細胞的激活、分化等其他功能中具有重要作用。

香菇多糖是從擔子菌傘科真菌香菇子實中提取出來的β-1，3-d-葡聚糖，從1970年Chihara第一次報道證實香菇多糖具有很強的抗腫瘤活性后，它被陸續證實具有明顯的抗菌、提高機體免疫等作用[3]。香菇多糖注射液作為一種具有免疫調節作用的抗腫瘤輔助藥物，廣泛應用于臨床，調查顯示它在許多醫院中藥制劑的應用中排在前三位[5]。目前，對香菇多糖促進T淋巴細胞增殖與活化的機制研究相對較少，并且對T淋巴細胞的增殖與活化是否與T淋巴細胞膜上的離子通道有關的研究仍未見報道。本研究將從基因水平對香菇多糖的作用機制進行研究，主要針對香菇多糖對小鼠T淋巴細胞膜上的離子通道基因表達的影響進行探討。

1 材料

1.1 儀器

DynaMag-15型磁力架（美國Life Technologies公司）；超低溫冰箱（青島澳柯瑪電器公司）；TL988型實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）儀（西安天隆科技有限公司）；MTC100型恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司）；TGL16型高速低溫離心機（長沙英泰儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

香菇多糖注射液（金陵藥業股份有限公司，批號:121001.1，規格:1.0mg/2ml）；胎牛血清、免疫磁珠試劑盒（美國Hyclone公司）；RNA提取試劑盒、引物（基因序列見表1）、cDNA試劑盒、RNA擴增試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

表1 基因序列Tab 1 Gene sequences

1.3 動物

健康KM小鼠40只，6～8周，♂，體質量（24±4）g，由山東青島實驗動物與動物實驗中心提供[實驗動物使用許可證號:SCXK（魯）20090007]。

2 方法

2.1 分組與給藥

40只KM小鼠隨機均分為4組，即對照（等容生理鹽水）組與香菇多糖高、中、低劑量（12.5、2.5、0.5mg/kg）組。ip給藥，每天1次，連續30d。

2.2 T淋巴細胞的提取

末次給藥1 h后，處死小鼠，取出脾臟，置于冷PBS（含0.1%胎牛血清+0.02%檸檬酸鈉）中，用免疫磁珠法從脾臟中提取T淋巴細胞。

2.3 qRT-PCR的測定

收集細胞，Trizol法提取RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉錄制備cDNA；PCR條件為:95℃預變性30 s；95℃變性15 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，循環數40次；72 ℃延伸5min終止反應。qRT-PCR結束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴增曲線結果的可靠性并設定循環閾值（Ct），以目的基因/β-actin比值分別代表各自相對表達水平。各組設3個復孔，實驗重復3次。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細胞KV1.3 mRNA表達的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細胞KV1.3 mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細胞上KV1.3 mRNA表達增強。小鼠脾臟T淋巴細胞KV1.3 mRNA的表達見圖1。

圖1 小鼠脾臟T淋巴細胞KV1.3 mRNA的表達與對照組比較:＊P＜0.05Fig 1 mRNA expression of KV1.3 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.2 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細胞KCa3.1 mRNA表達的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細胞KCa3.1 mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細胞上KCa3.1 mRNA的表達增強。小鼠脾臟T淋巴細胞KCa3.1 RNA的表達見圖2。

3.3 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細胞orai1 mRNA表達的影響

圖2 小鼠脾臟T淋巴細胞KCa3.1 mRNA的表達與對照組比較:＊P＜0.05Fig 2 mRNA expression of KCa3.1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細胞orai1 mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細胞CRAC通路上的調控元件orai1 mRNA表達增強。小鼠脾臟T淋巴細胞orai1 mRNA的表達見圖3。

圖3 小鼠脾臟T淋巴細胞orai1 mRNA的表達與對照組比較:＊P＜0.05Fig 3 mRNA expression of orai1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.4 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細胞STIM1 mRNA表達的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細胞STIM1 mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細胞CRAC通路上的調控元件STIM1 mRNA表達增強。小鼠脾臟T淋巴細胞STIM1 mRNA的表達見圖4。

圖4 小鼠脾臟T淋巴細胞STIM1 mRNA的表達與對照組比較:＊P＜0.05Fig 4 mRNA expression of STIM1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.5 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細胞TRPM7 mRNA表達的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細胞TRPM7 mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細胞上TRPM7 mRNA表達增強。小鼠脾臟T淋巴細胞TRPM7 mRNA的表達見圖5。

圖5 小鼠脾臟T淋巴細胞TRPM7 mRNA的表達與對照組比較:＊P＜0.05Fig 5 mRNA expression of TRPM7 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.6 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細胞Clswell mRNA表達的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細胞Clswell mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細胞上Clswell mRNA表達增強。小鼠脾臟T淋巴細胞Clswell mRNA的表達見圖6。

圖6 小鼠脾臟T淋巴細胞Clswell mRNA的表達與對照組比較:＊P＜0.05Fig 6 mRNA expression of Clswell in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

4 討論

香菇多糖主要用于腫瘤患者，臨床試驗證明，它對人的惡性腫瘤具有有效的抑制作用[6]。它主要的作用機制是促進T、B淋巴細胞增殖[7]，提高自然殺死（NK）細胞的活性，調節免疫力，從而維持機體內環境穩定，同時它還能促進T淋巴細胞產生一氧化氮（NO）、白細胞介素（IL）-2來抵抗放療對機體的損傷[8]。T淋巴細胞上的CRAC是細胞外Ca2+進入細胞內的重要通路[1]。STIM1和orai1作為CRAC通路中的調控元件作用于內質網上的Ca2+庫，以致Ca2+持續釋放到細胞液內，使游離Ca2+濃度升高，一定濃度的Ca2+與STIM1、orai1共同作用使細胞外的Ca2+進入到細胞內，使細胞內的Ca2+濃度升高[9]。Ca2+作為第二信使，濃度升高能夠激活細胞內的基因表達，活化T淋巴細胞。Ca2+濃度升高還能激活離子通道KCa3.1，研究表明，KCa3.1的高表達能夠強烈地增強T淋巴細胞的活性并促進其增殖[10]。早在1988年就有研究表明，鉀離子通道的高表達能夠迅速地使小鼠胸腺細胞增殖[11]。KV1.3通道的表達與激活T淋巴細胞的活性以及增殖有著密切的關系[12]。qRT-PCR結果顯示，中劑量香菇多糖使KV1.3、KCa3.1、STIM1、orai1的基因表達明顯增強，因此可以推斷香菇多糖可以明顯增強小鼠T淋巴細胞的增殖和活性，其機制與影響KV1.3、KCa3.1、STIM1、orai1的基因表達有密切關系。

香菇多糖對細胞的體積具有一定的調控作用。T淋巴細胞上的Clswell在T淋巴細胞的體積調節過程中發揮著至關重要的作用，因此又稱它為容量調控氯離子通道[1]。通常Clswell與鉀離子通道共同作用使容積變大的T淋巴細胞恢復至正常體積，從而使T淋巴細胞內環境穩定，發揮細胞免疫的功能。TRPM7是一種非選擇性的陽離子通道，對Ca2+、Mg2+、K+、Na+等眾多二價和單價陽離子有通透性，同時又是一種蛋白激酶，可使自身或底物磷酸化[4]。在T淋巴細胞的增殖活化過程中離不開底物磷酸化，同時，在T淋巴細胞正常功能的維持過程中離不開Ca2+、Mg2+、K+、Na+等眾多二價和單價陽離子平衡。因此，在T淋巴細胞的增殖活化過程中離不開Clswell通道和TRPM7通道。由此推斷香菇多糖對T淋巴細胞的一系列作用與對Clswell通道和TRPM7通道的基因表達關系密切。

Attia SM等[13]研究表明，香菇多糖對DNA的損傷修護作用具有劑量依賴性。付青姐等[14]研究香菇多糖保護小鼠脾臟抵御輻射損傷的實驗結果表明，香菇多糖在2.5、0.5mg/kg的劑量下可明顯緩解輻射造成的脾臟損傷。許多研究也證實，香菇多糖的免疫調節作用具有一定的劑量依賴性。本研究表明，香菇多糖在不同劑量下基因的表達有一定差異性，所有的基因表達結果顯示，中劑量的香菇多糖能夠使5種離子通道的基因表達上調，而高劑量和低劑量香菇多糖對5種離子通道的基因表達雖有所影響，但是均不具有統計學意義，說明香菇多糖在適宜劑量下可以上調5種離子通道的基因表達，調節T淋巴細胞活性，從而發揮免疫調節的作用。

綜上所述，香菇多糖具有增加T淋巴細胞的增殖和活性、調節免疫的作用，與提高離子通道KV1.3、KCa3.1、TRPM7、Clswell以及Ca2+通道調控元件STIM1、orai1的基因表達有密切關聯。

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