miR-146a基因多態性與腔隙性腦梗死的關系

(廣東醫學院附屬醫院，廣東湛江524001)

腔隙性腦梗死(LI)是腦卒中最常見的一種類型，盡管病變面積不大，也會造成嚴重功能障礙，如血管性癡呆等［1］。微小RNA(miRNA)參與調節動脈粥樣硬化(AS)的形成，而AS是常見腦血管病的共同病理基礎［2，3］。研究證明，miR-146a 在人 AS 斑塊中顯著上調［3］，其多態性已被證實與多種疾病的發生相關［5～7］，但與LI的相關性尚未見報道。2011年2月 ～2012年 9月，我們探討了 miR-146a rs2910164和rs57095329位點的基因多態性與LI的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入患者均符合全國第四屆腦血管病會議修訂的LI診斷標準，并經頭顱CT/MRI證實，梗死灶直徑＜15mm;排除房顫、血液病、結核、惡性腫瘤、大動脈炎、周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病及嚴重肝腎功能不全者。選擇廣東醫學院附屬醫院就診并符合上述標準的患者173例(觀察組)，與觀察組性別、年齡匹配的非心腦血管疾病門診體檢者298例(對照組)。觀察組男118例、女55例，年齡(69.89±9.78)歲;對照組男 192 例、女 106 例，年齡(69.58±8.72)歲。

1.2 方法

1.2.1 miR-146a基因型檢測 采用SNaPshot法。采集空腹靜脈血0.5 mL，按試劑盒說明書提取基因組DNA。選擇miR-146a的多態位點rs2910164和rs57095329［5，7］，采用 Primer3.0 軟件設計合成引物，rs2910164上游引物:5'-AACTGAATTCCATGGGTTG-3'，下游引物:5'-CACGATGACAGAGATATCCC-3'，擴增長度:232 bp;rs57095329上游引物:5'-TCATTGGGCAGCCGATAAAG-3'，下游引物:5'-AGGAAGTTCTGGTCAGGCG-3'，擴增長度:318 bp。PCR 反應體系為 20 μL:10 ×HotStarTaq buffer 2.0 μL，3.0 mm Mg2+4.0 μL，上、下游引物各20 pmol，0.3 mm dNTP 0.5 mmol，1 U HotStarTaq DNA Polymerase 1.0 U，樣本 DNA 0.2～0.5 μg及滅菌去離子水適量。擴增條件:95℃ 2 min;94℃ 20 s，65℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共11個循環;94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72℃ 90 s，共24個循環;72℃ 2 min，4℃保存。PCR產物經純化后，上樣于ABI3130XL測序儀中，使用GeneMapperV4.1軟件對結果進行分析。

1.2.2 頸動脈內膜中層厚度(CIMT)檢測 采用B型彩色多普勒超聲儀，探頭頻率為10 MHz。分別測量患者兩側頸總動脈前后壁的CIMT，取其平均值。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miR-146a基因多態性比較 兩組miR-146a rs2910164和rs57095329位點的基因型分布經χ2檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡，表明該基因型分布在所研究的人群中已達到了遺傳平衡，可以進行候選基因的關聯分析。兩組miR-146a基因多態性比較，見表1。

2.2 兩組不同性別、年齡miR-146a基因多態性比較 見表2。

表1 兩組m iR-146a基因的基因型和等位基因頻率比較［例(%)］

表2 兩組不同性別、年齡m iR-146a基因型和等位基因頻率比較［例(%)］

2.3 觀察組miR-146a正常和突變基因型患者的CIMT比較 觀察組miR-146a rs2910164位點CC、CG+GG基因型患者的 CIMT分別為(0.128±0.028)、(0.137±0.051)cm，miR-146a rs57095329 位點 AA、AG+GG基因型患者的 CIMT分別為(0.134±0.046)、(0.131 ±0.035)cm，P 均 ＞0.05。

3 討論

近年來LI發病率持續升高，顱內穿支AS被認為是LI的重要病因［8］。據推測，人類基因組上約有1/3的基因受到miRNA的調控，其調節紊亂可導致多種病理過程［9］。miR-146a通過TLR介導的信號通路參與細胞的天然免疫，調節炎癥應答、腫瘤發展及抗病毒免疫［8，10］;靶向 CD40L來調節炎癥性細胞因子的分泌和成熟過程［11］;靶向TLR4抑制ox-LDL誘導的脂質積累和炎癥應答［12］。miR-146a在人AS斑塊中顯著上調［3］，并能促進 Th1細胞的分化［13，14］。miR-146a 前體中 rs2910164 的多態性已被證實與肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌等疾病相關［5～7，10］，而 rs57095329 位點也被證實能影響miR-146a的成熟，與系統性紅斑狼瘡的易感性相關［7］。

本研究中發現，攜帶rs2910164位點GG基因型或G等位基因的人群，其患LI的風險顯著降低，原因可能是rs2910164位點的C/G變異影響了前體miR-146a的成熟和 miR-146a的表達，使得 miR-146a在AS中的作用被削弱。本研究還發現，兩組不同性別者miR-146a rs2910164和rs57095329位點的基因型和等位基因頻率無顯著差異，而攜帶miR-146a rs2910164位點G等位基因70歲以下者患LI的風險顯著降低。最近一項韓國的研究認為，miR-146a rs2910164位點的G等位基因在缺血性腦卒中起致病作用［15］;而 Liu 等［16］在中國漢族人群中的研究認為，miR-146a rs2910164多態與缺血性腦卒中的發病無關。以上均與本研究中 miR-146a rs2910164的G等位基因可能是LI保護性因素的觀點相悖，可能與種族差異、入組標準、試驗方法及其他環境因素等對結果的影響有關。

CIMT是AS早期表現形式的一種，大量研究證實，CIMT升高與AS進展及腦梗死的發病相關。因此，CIMT被認為是腦梗死的強效預測因子。本研究結果顯示，miR-146a rs2910164和rs57095329的基因突變對LI患者CIMT的影響無顯著性差異，這可能與miR-146a基因在AS早期對CIMT的影響不明顯有關。

綜上所述，LI患者miR-146a基因rs2910164位點G等位基因頻率降低，G等位基因可能是其發病的一種保護性因素。未來的研究中，我們仍需擴大樣本進行檢測，進一步對miR-146a基因多態性對LI發病的影響及作用機制進行探討。

［1］Lo AC，Guarino PD，Richards LG，et al.Robot-assisted therapy for long-term upper-limb impairment after stroke［J］.N Engl J Med，2010，362(19):1772-1783.

［2］Hansson GK.Inflammation，atherosclerosis，and coronary artery disease［J］.N Engl JMed，2005，352(16):1685-1695.

［3］Raitoharju E，Lyytikainen LP，Levula M，et al.miR-21，miR-210，miR-34a，and miR-146a/b are up-regulated in human atherosclerotic plaques in the Tampere Vascular Study［J］.Atherosclerosis，2011，219(1):211-217.

［4］熊瑋，董少紅，袁建輝，等.MiRNA-146a通過 NF-κB依賴的途徑促進血管平滑肌細胞增殖［J］.南方醫科大學學報，2012，32(2):270-273.

［5］Jazdzewski K，Liyanarachchi S，Swierniak M，et al.Polymorphic maturemicroRNAs from passenger strand of pre-miR-146a contribute to thyroid cancer［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(5):1502-1505.

［6］Xu B，Feng NH，Li PC，et al.A functional polymorphism in PremiR-146a gene is associated with prostate cancer risk and mature miR-146a expression in vivo［J］.Prostate，2010，70(5):467-472.

［7］Luo X，Yang W，Ye DQ，et al.A functional variant in microRNA-146a promoter modulates its expression and confers disease risk for systemic lupus erythematosus［J］.PLoSGenet，2011，7(6):e1002128.

［8］Del Bene A，Palumbo V，Lamassa M，et al.Progressive lacunar stroke:review of mechanisms，prognostic features，and putative treatments［J］.Int JStroke，2012，7(4):321-329.

［9］Ying SY，Chang DC，Lin SL.The MicroRNA［J］.Methods Mol Biol，2013，936:1-19.

［10］Li L，Chen XP，Li YJ.MicroRNA-146a and human disease［J］.Scand J Immunol，2010，71(4):227-231.

［11］Chen T，Li Z，Jing T，et al.MicroRNA-146a regulates thematuration process and pro-inflammatory cytokine secretion by targeting CD40L in oxLDL-stimulated dendritic cells［J］.FEBSLett，2011，585(3):567-573.

［12］Yang K，He YS，Wang XQ，et al.MiR-146a inhibits oxidized low-density lipoprotein-induced lipid accumulation and inflammatory response via targeting toll-like receptor4［J］.FEBSLett，2011，585(6):854-860.

［13］Guo M，Mao X，Ji Q，et al.MiR-146a in PBMCsmodulates Th1 function in patients with acute coronary syndrome［J］.Immunol Cell Biol，2010，88(5):555-564.

［14］Ji R，Cheng Y，Yue J，et al.MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation［J］.Circ Res，2007，100(11):1579-1588.

［15］Jeon YJ，Kim OJ，Kim SY，et al.Association of the miR-146a，miR-149，miR-196a2，and miR-499 polymorphisms with ischemic stroke and silent brain infarction risk［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33(2):420-430.

［16］Liu Y，Ma Y，Zhang B，et al.Genetic polymorphisms in pre-microRNAs and risk of ischemic stroke in a Chinese population［J］.J Mol Neurosci，2013，［Epub ahead of print］.