四氯乙烯脅迫對草魚抗氧化酶活性的影響及其機理

王桂燕,李 鋒,史濟月,周啟星 (.沈陽藥科大學制藥工程學院,遼寧 沈陽 006；.沈陽大學師范學院,遼寧 沈陽 0044；3.南開大學環境科學與工程學院,環境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津 30007)

四氯乙烯(PCE)廣泛用作干洗劑和金屬脫脂劑.PCE的大規模使用,以及對其不能充分回收,致使部分PCE在使用過程中釋放出來,排放到空氣、水或土壤中去,成為工廠車間、地表水和地下水中常見的污染物.國際腫瘤研究中心(IARC)將其列入人類可能致癌物(B2級)[1].外界污染物脅迫情況下,生物體體內會產生大量的過剩自由基,引起對生物體的氧化脅迫,導致細胞膜脂質過氧化,生物體生理代謝功能紊亂.超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)是生物體體內抗氧化防御系統的重要保護酶,它們能在一定基礎上清除活性氧自由基,維持膜系統的穩定,降低氧化脅迫對細胞的傷害程度.抗氧化防御系統成分的改變可以作為機體受到氧化脅迫的早期預警生物標志物[2-3],其含量水平、活性大小可作為測定生物對外界氧化脅迫反應的生理生化指標,測定在氧化脅迫下草魚組織內SOD和POD的活性,可以從一個側面揭示污染物對生物的毒性機制,間接反映環境中有毒有害物質的存在.為此,以草魚(Ctenopharyngodon idellus)為試驗對象,研究 PCE對草魚的肝胰臟、腎臟和鰓組織的 SOD和POD的影響,探討以SOD和POD活性變化作為PCE污染生物指標的可能性,為抗氧化防御系統的毒理學研究提供更多的基礎資料.并為水環境中該化合物污染影響的早期預報和防治提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試動物 草魚購自沈陽北市場.選擇標準:頭小體闊,鱗片完整舒展,行動活潑、反應靈敏、逆水性強,外觀正常,個體均勻的健康魚,體長＜5cm,最大與最小體長之比＜1.5,體重為 (4.10±0.74)g.運回實驗室放入大型水族缸中,馴養7d(期間死亡率低于 5%)后進行實驗.實驗用水為充分曝氣的自來水.

1.1.2 供試化合物 PCE,購自天津基準化學試劑有限公司,氯化硝基四氮唑藍(NBT),L-蛋氨酸,核黃素,磷酸氫鈉,磷酸二氫鈉,EDTA,無水乙醇等為市售,均為分析純.

1.1.3 主要儀器 高速低溫冷凍離心機(HITACHI CP 80MX),紫外/可見分光光度計(WFZ 800–D3B),恒溫光照培養箱(MGC-350BP-2),溶解氧測定儀(HI9143).

1.2 實驗步驟與方法

采用靜態試驗法[4-5].試驗中用水為充分曝氣之后的自來水,水溫(17±1),pH℃值為6.5～6.8,溶解氧(DO)含量為 5.0mg/以上,硬度在210.1mg/L(以 CaCO3計)左右.試驗在 25cm×18cm×25cm的小水族缸中進行.定期監測溶液的溫度、pH值、DO.水族缸全天曝氣.為防止餌料的影響,試驗期間不喂食.

將一定量的四氯乙烯用無水乙醇(乙醇的體積分數不超過10%)溶解,然后用事先充分曝氣的自來水稀釋到所需實驗濃度.

1.2.1 試驗濃度設計 在單一急性毒性試驗基礎上,求得PCE污染物96h的LC50值為34.56mg/L[6],然后分別選取 1/2LC50、1/4LC50、1/8LC50和1/16LC504個濃度組,每個濃度設3個平行組,同時設1個空白對照組,每1濃度組隨機放魚10尾.

1.2.2 酶活性測定 PCE暴露試驗每隔24h更換1次新鮮試驗液.分別在暴露的第24、48、72、96、120、144和168h從每濃度組中和對照組中隨機取出3條草魚,迅速解剖,取肝胰臟、腎臟和鰓等組織,然后于 50mmol/L預冷磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8,含0.1mmol/L的EDTA)中勻漿,將勻漿液轉移到10mL離心試管中于4℃、15000r/min條件下低溫離心 30min,上清液即為酶提取液,將其低溫保存.SOD活性的測定采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光化還原法[7],1個酶活性單位(U)定義為引起3.0mL反應液達到50%抑制所需的酶量,酶活性以U/g·FW表示.POD的活性測定采用愈創木酚(鄰甲氧基苯酚)法[7],定義在波長470nm處吸光度值變化0.01代表1個酶活力單位(U),酶活性以 U/(g·FW·min)表示,組織質量均以鮮質量計.

1.3 數據處理

采用SPSS13.0統計軟件對試驗數據進行分析,數據用平均數±標準偏差(Mean±SD)表示.并用t檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著.

2 結果與分析

2.1 PCE對草魚SOD活性的影響

2.1.1 PCE對草魚肝胰臟SOD活性的影響 從表1可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度增加,24和48h內草魚肝胰臟SOD活性變化顯著(P＜0.05).與0mg/L相比,草魚肝胰臟SOD活性在最低濃度組(2.17mg/L)時,受到顯著誘導(P＜0.05),在其他濃度組時其活性又被顯著抑制(P＜0.05);暴露 72h,最高濃度組(17.28mg/L)的草魚肝胰臟SOD 活性仍然被顯著抑制(P＜0.05),其他較低濃度組的草魚肝胰臟 SOD活性均被顯著誘導(P＜0.05);暴露 96h,所有濃度組的草魚肝胰臟SOD 活性均被顯著誘導(P＜0.05);當暴露時間繼續增加到 120h以上時,所有濃度組草魚肝胰臟SOD 活性被抑制,其活性顯著低于對照(P＜0.05).方差分析表明,暴露濃度對草魚肝胰臟SOD活性影響極顯著(P＜0.01),暴露時間對草魚肝胰臟SOD活性影響顯著(P＜0.05),并且PCE濃度與暴露時間存在顯著的交互作用(P＜0.01).

表1 PCE對草魚肝胰臟SOD活性的影響(U/g·FW)Table 1 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp liver tissues

2.1.2 PCE對草魚腎臟SOD活性的影響 從表2可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度的增加,24h內草魚腎臟 SOD活性變化顯著降低(P＜0.05);48h時草魚腎臟在2.17和4.34mg/L時,受到顯著抑制(P＜0.05),而在 8.69和 17.28mg/L時其活性又被誘導,均顯著高于對照(P＜0.05);在暴露 72h時,低濃度組(2.17mg/L)草魚腎臟被顯著誘導(P＜0.05),而在 4.34mg/L以上濃度組腎臟的 SOD活性被極顯著抑制(P＜0.01);在暴露 96h以上時,各個濃度組的草魚腎臟SOD活性均被顯著抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露濃度和暴露時間對草魚腎臟 SOD活性影響顯著(P＜0.05),并且 PCE濃度與暴露時間存在顯著的交互作用(P＜0.01).

表2 PCE對草魚腎臟SOD活性的影響(U/g·FW)Table 2 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp kidney tissues

2.1.3 PCE對草魚鰓組織 SOD活性的影響 從表3可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度的增加,24h內當濃度為 2.17mg/L時,草魚鰓組織SOD 活性變化顯著降低(P＜0.05),而當濃度增加到4.29mg/L鰓組織的SOD活性又恢復到與對照組沒有顯著差異(P＞0.05),當濃度繼續增加時,鰓組織的SOD活性又呈現顯著被抑制(P＜0.05);暴露48h以上時草魚鰓組織在污染暴露的濃度組中均呈現顯著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露濃度和暴露 時間對草魚鰓組織SOD活性影響不顯著(P＞0.05).

表3 PCE對草魚鰓組織SOD活性的影響(U/g·FW)Table 3 Effects of PCE on the SOD activity (U/g·FW) in the grass carp gill tissues

2.2 PCE對草魚POD活性的影響

2.2.1 PCE對草魚肝胰臟POD活性的影響 從表4可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度的增加,24h內草魚肝胰臟 POD活性變化顯著(P＜0.05).與0mg/L相比,草魚肝胰臟POD活性在暴露的濃度范圍內均受到顯著抑制(P＜0.05);在暴露48h時,在2.17、4.34和8.69mg/L濃度組活性顯著低于對照(P＜0.05),而在最高濃度組(17.28mg/L),其 POD 值又被誘導,顯著高于對照(P＜0.05);暴露72h時,在4.34mg/L濃度組肝胰臟POD 活性被誘導,其值顯著高于對照(P＜0.05);在暴露96h以上,草魚肝胰臟的POD活性顯著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露時間對草魚肝胰臟POD活性影響極顯著(P＜0.01),并且PCE濃度與暴露時間存在顯著的交互作用(P＜0.01).

2.2.2 PCE對草魚腎臟POD活性的影響 從表5可以看出,在PCE污染條件下,隨著暴露濃度的增加,24h內草魚腎臟 POD活性變化顯著(P＜0.05),低濃度組(2.17mg/L)草魚腎臟 POD 顯著高于對照組(P＜0.05),而高濃度組的POD值都顯著低于對照組(P＜0.05);48h時草魚腎臟在較低濃度(2.17和4.34mg/L)組,受到顯著抑制(P＜0.05),而在較高濃度(8.69和17.28mg/L)時其活性又被誘導,均顯著高于對照(P＜0.05);在暴露 72h時,低濃度組(2.17mg/L)草魚腎臟 POD活性被顯著誘導(P＜0.05);在暴露120h以上時,各個濃度組的草魚腎臟POD活性均被顯著抑制(P＜0.05).方差分析表明,PCE暴露時間對草魚腎臟POD活性影響極顯著(P＜0.01),并且 PCE濃度與暴露時間存在顯著的交互作用(P＜0.01).

表4 PCE對草魚肝胰臟POD活性的影響[U/(g·FW·min)]Table 4 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp liver tissues

2.2.3 PCE對草魚鰓組織 POD活性的影響 從 表6可看出,隨著PCE暴露濃度的增加,24h內各暴露的濃度內草魚鰓組織 POD活性變化顯著增加(P＜0.05);隨著染毒時間的延長,較低濃度組鰓組織的POD活性被誘導,顯著高于對照(P＜0.05),而當濃度增加到17.28mg/L時,鰓組織的POD活性又恢復到與對照無顯著差異(P＞0.05);當染毒時間延長到144h以上時,各暴露的濃度組內鰓組織的POD活性又呈現顯著被抑制(P＜0.05).方差分析表明,暴露時間對草魚鰓組織POD活性影響顯著(P＜0.05).

表5 PCE對草魚腎臟POD活性的影響[U/(g·FW·min)]Table 5 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp kidney tissues

表6 PCE對草魚鰓組織POD活性的影響[U/(g·FW·min)]Table 6 Effects of PCE on the POD activity [U/(g·FW·min)]in the grass carp gill tissues

3 討論

當有機體受到污染脅迫時,其體內抗氧化系統酶活性改變,發生氧化應激作用,這種氧化應激作用因有機體及污染物種類、脅迫濃度和暴露時間不同而不同[8-11].氧化應激反應是生物體的活性氧簇(ROS)和抗氧化防御系統之間不平衡的結果

[12],ROS是過渡金屬離子、農藥、石油污染物等物質誘導產生的[13].ROS 的逐步產生可以導致蛋白質和脂質的氧化,基因表達的改變以及細胞氧化還原狀態的變化[14].抗氧化防御系統作為活性氧的去除系統, 在參與活性氧的清除以及機體的保護性防御反應中發揮巨大作用, 主要包括酶系統(SOD、POD 等)與一些小分子抗氧化物.生物體的抗氧化防御系統對污染物脅迫相當敏感,特別是SOD對多種污染物的反應均很敏感.SOD被認為是抵抗過氧化反應的保護酶之一[15],是生物體內唯一以超氧陰離子作為專一性底物的抗氧化酶.在PCE脅迫下,低濃度(2.17mg/L)的PCE脅迫較短時間(96h)內導致草魚肝胰臟組織的 SOD活性首先升高,說明此時草魚肝胰臟和腎臟體內積累了大量的活性氧自由基,SOD為清除這些干擾物質而被誘導.已有研究表明,生物受到輕度逆境脅迫時,SOD活性往往升高[16].如水絲蚓在Hg2+的應激條件下,當 Hg2+濃度在 8.000～9.241μL/L范圍時,SOD活性顯著上升[17];暴露于 0.5mg/L BaP中7d時,大彈涂魚肝臟中SOD活性被顯著誘導[18];草魚在低濃度(0.01mg/L和 0.20mg/L)十二烷基硫酸鈉暴露時,肌肉、血漿及肝臟SOD均受到不同程度的誘導[19],這些與本試驗中得到的結果基本一致.另外,在 PCE脅迫下,低濃度(2.17mg/L)的PCE脅迫較短時間(96h)內也導致草魚腎臟組織和鰓組織的POD活性也升高. POD是生物體內重要的抗氧化防御系統,可催化過氧化氫與氫供給體之間的氧化反應,從而分解有毒物質H2O2.當生物體受到輕度逆境脅迫時,POD活性往往升高,以清除體內的活性氧自由基.然而抗氧化酶清除自由基的能力畢竟有限,在長期的氧化脅迫下,氧化損傷難以避免,進而造成機體細胞病變導致疾病發生.一些研究也表明,抗氧化酶活性的變化與污染物的濃度具有相關性[20],在其耐性限度內,隨著污染物濃度的增加,POD和SOD活性也增加;但超過了其耐性閾值,細胞受到嚴重傷害,導致其應激的能力下降,因此POD和SOD活性也就不可避免地降低,因此一般情況下,嚴重脅迫能夠導致POD、SOD酶活下降[21-23].本研究中,發現過度脅迫時也能夠導致魚體內的SOD和POD酶活性受到顯著的抑制.這一方面可能是由于草魚出現中毒癥狀,致使SOD代謝外源性化合物的能力受到破壞或飽和[24],另一方面可能是由于草魚體內抗氧化防御系統的其他成分的介入,清除了部分活性氧[25].另外可能是當重度或長時間逆境脅迫超出生物體抗氧化防御系統的防御能力時,致使POD活性降低,使生物體內積累過量的活性氧,從而傷害生物體.PCE通過與酶發生相互作用而改變其蛋白結構,從而改變其功能活性[26].在試驗48h和76h時草魚腎臟POD活性變化出現波動,其原因有待于進一步試驗研究.草魚鰓組織只有在中等濃度組(4.34mg/L)在24h內SOD酶活性與對照組沒有顯著變化(P＞0.05),其它濃度組在整個暴露時間內 SOD酶均受到顯著抑制(P＜0.05).鰓組織的POD酶活性在24h內均顯著升高,隨后就降低.草魚肝胰臟、腎臟和鰓組織中SOD活性和敏感性的不同,可能與它們的不同生理功能有關.肝臟是體內主要的解毒器官,肝巨噬細胞有活躍的吞噬能力,毒物在肝臟內氧化、還原或水解過程中會產生大量的O2-,從而使肝組織SOD活性較高.另外,草魚在PCE暴露時,PCE由鰓進入血液作用到很多靶組織細胞,這些被傷害的組織細胞產生的代謝紊亂產物又匯集到肝臟,從而引起肝組織SOD活性的變化.腎臟是機體排泄污染物及其代謝產物的重要臟器,由于在腎內毒物代謝產物得到濃縮,因而對腎組織引起損害產生腎毒性.而鰓只是呼吸器官,既不具備解毒功能又沒有排泄功能,因此鰓組織的SOD活性要比肝和腎的低得多.筆者認為,由于魚首先通過鰓呼吸,污染物最先接觸鰓組織,所以鰓組織的酶活性降低.

在試驗中筆者觀察到,當草魚受PCE脅迫短時間內肝胰臟和腎臟組織中SOD和POD酶活性首先受到抑制,隨著暴露時間的延長,草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD和POD活性又顯著升高(如草魚暴露在4.34mg/L和8.69mg/L濃度組中,其肝胰臟組織SOD酶活性在48h內首先被顯著抑制,污染暴露 72h其酶活性又被顯著誘導).這種現象與Beaumont等[27]的研究結果類似.Stebbing[28]認為毒物在低濃度下出現的這種現象,是其在無毒情況下的刺激反應,他把這一現象稱為“毒物興奮效應”.迄今為止,研究證明,“毒物興奮效應”具有普遍性[29].SOD、POD酶活性升高一方面說明草魚受到了一定的刺激; 另一方面也說明草魚對外界刺激的反應能力很強,通過提高酶活性來保護機體免受更深的損傷.隨著 PCE脅迫暴露的時間繼續延長,草魚肝胰臟和腎臟SOD和POD酶活性再次顯著降低,最后出現草魚個體死亡.可見SOD和POD酶活性的降低所造成的活性氧傷害是引起草魚死亡的重要原因之一.

4 結論

4.1 草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD、POD酶活比鰓組織的高.

4.2 PCE脅迫導致草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD和POD活性均有顯著變化. SOD、POD酶活能夠反映出污染物對草魚的毒性作用.

4.3 較低濃度的脅迫能夠誘導草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD、POD酶活,但是過度脅迫將導致草魚肝胰臟和腎臟組織的SOD、POD酶活的下降,進而產生毒性效應. SOD和POD酶活性的降低所造成的活性氧傷害是引起草魚死亡的重要原因之一.

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