海馬神經元原代培養方法

肖興莉，楊朝鮮，高小青，陳秀（瀘州醫學院:附屬醫院神經內科；神經生物教研室，四川瀘州646000）

海馬神經元原代培養方法

肖興莉，楊朝鮮1，高小青1，陳秀
（瀘州醫學院:附屬醫院神經內科；1神經生物教研室，四川瀘州646000）

目的:掌握海馬神經元的有效培養方法和細胞保存培養方法，利于細胞模型的建立。方法:取出出生1 d的SD大鼠海馬，聯合機械吹打法和胰酶消化法分離海馬細胞，加入DMEM/F12+10%FBS制備細胞懸液，接種在玻璃培養瓶內1～2 d，收集上清細胞液、離心、重懸細胞；再接種在培養板上，培養1 d后，全液更換為Neurobasal+2%B27,以后每3 d半量換液。利用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化；利用NF-200、Neu-N抗體免疫熒光、免疫組化技術鑒定海馬神經元；利用96孔板培養細胞，計數每個孔海馬細胞比例；利用MTT法測定細胞活性。結果:接種在培養板上第1 d細胞貼壁，第3～4 d細胞長出突觸，第7～8 d細胞突觸生長迅速，第11～13 d細胞交織成網狀，第15～20 d細胞生長旺盛，20 d后細胞形態開始改變。免疫熒光技術鑒定細胞突觸呈紅色，細胞核呈綠色；免疫組化技術鑒定突觸和胞核都呈棕黃色。細胞純度95～97.5%，細胞活性以15～17 d最高（93.94～95.13%），與其他時間點比較，P＜0.01。結論：該方法簡便可行，節約取材及時間，可獲得純度高、活性好的海馬細胞，為后續研究提供實驗基礎。

海馬神經元；原代培養；細胞保存培養

海馬是大腦邊緣系統的重要結構之一，參與內臟活動和情緒活動的調節，以及個人保存和種族保存的維持，同時與學習記憶活動密切相關，特別是近期記憶。海馬是中樞神經系統神經形成的特殊結構[1]。近來研究證明，海馬結構早期變化參與Alzheimer'sdisease(阿爾茨海默病，AD)、海馬硬化癥、癡呆等相關神經元退行性疾病的病理生理過程[2]。正是由于海馬結構和功能的重要性，對于它的研究較多，但是在細胞水平和亞細胞結構方面的研究較少，本實驗提供了一較好的細胞模型基礎，為后續研究做準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和器材

大鼠抗NF-200單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗Neu-N單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；B27 Serum-Frrsupplement購自Gibco公司；DMEM/F12培養基購自Hyclone公司；多聚-D-賴氨酸（poly-D-lysine）購自Sigma公司；Neurobasal培養液購自Gibco公司；Goatanti-rabbit IgG(H+L)FITC conjugated購自北京博奧森生物技術有限公司，羅丹明標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋；抗熒光淬滅封片液（強）購自碧云天生物技術研究所；MTT購自Sigma公司；青霉素-鏈霉素購自北京博奧森生物技術有限公司；培養板、培養瓶若干。

1.1.2 實驗動物

新生24h的SD大鼠2只，購自瀘州醫學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑

1.2.1 主要試劑的配置

①細胞爬片液的配置：用購自Sigma公司的poly-D-lysine原液分裝，以1∶10的比例用0.01mol/L的PBS液配置，4°C保存備用；②FBS的滅活：FBS用10m l的離心管分裝備用，-20°C保存。用前先在37°C溶解，再在55°C～60°C下滅活30min；③細胞種植液和無血清培養液的配置：DMEM/F12+10% FBS+1%青霉素-鏈霉素；Neurobasal+2%B27+1%青霉素-鏈霉素；4°C保存備用；④一抗和二抗的配置：NF-200、Neu-N、Goatanti-rabbit IgG(H+L)FITC conjugated、羅丹明標記山羊抗小鼠IgG分別用0.01 mol/L的PBS稀釋至1∶300、1∶100，一抗-20°C保存備用；二抗現用現配。

1.2.2 細胞爬片的制備

選擇與培養板大小合適的蓋玻片，清洗、泡酸過夜、消毒、烘干。分別放入培養板內，每個蓋玻片上滴一滴爬片液、鋪勻、37°C孵箱孵育過夜；次日吸出多余的爬片液，用無菌蒸餾水沖洗3遍，讓其自然風干，至少4h，備用[3]。

1.2.3 取材

①消毒：用新生SD大鼠2只，先用酒精浸泡1 min，再用碘伏消毒；②固定、暴露、定位：左手固定頭部，新生鼠頭腹曲，首先用無菌眼科剪把皮膚和顱骨剪開，向前翻；暴露出全部大腦，在其中后1/3的地方輕輕剝離出像月牙狀的對稱海馬組織（見圖1）；③清洗：放入盛有無菌PBS的培養皿中，剝離腦膜，清洗組織；④剪切、機械吹打、消化：干凈后放入無菌的干燥培養皿內，用眼科剪剪碎成稀糊狀，再吸入裝有組織體積4倍的DMEM/F12培養液的離心管內，用吸管吹打50次左右，靜置5min后，吸取上清液，剩下的沉淀再按照相同的比例加入DMEM/F12，再加入等體積的0.25%的胰酶，在常溫下，邊吹打邊觀察，液體變得均勻混濁后加入等體積的FBS終止消化。最后配平，1100 r/min離心，收集細胞沉淀。以上都要在冰上操作。

圖1 分離出的新鮮海馬組織

1.2.4 細胞懸液的制備和接種

收集的細胞加入細胞體積3倍的種植液，吹打混勻，用2%臺盼藍和白細胞計數板粗略檢測活細胞濃度，接種在50ml的玻璃培養瓶中。

1.2.5 細胞差速貼壁

細胞接種在培養瓶1～2 d后，收集上清液、1100 r/min離心、收集細胞。同樣加入細胞體積3倍的種植液，吹打混勻，用2%臺盼藍和白細胞計數板粗略檢測活細胞濃度，1×104～1×105個/L接種300μl的細胞懸液在多聚賴氨酸包被好的24孔培養板上。培養1 d后，全量更換種植液為無血清培養液，此后每3 d半量換液，每天觀察細胞的生長情況。

1.2.6 細胞保存培養

對于一次取材太多，為減少取材的次數，不讓細胞浪費，可把培養瓶內的細胞在第一次收集后，又重懸細胞懸液，接種在新的培養瓶內，繼續貼壁生長，4 d左右又可收集細胞懸液，繼續前方法，把貼壁的細胞用胰酶消化收集、離心、重懸、接種在培養板上，如上方法培養。

1.2.7 細胞的鑒定

對生長成熟的海馬神經元去除培養基，4%多聚甲醛固定細胞、0.3%Tritonx-100打孔、0.3%H2O2去除過氧化物酶、山羊血清封閉非特異性抗體、一抗NF-200、Neu-N 4°C過夜、熒光二抗閉光室溫孵育1 h、免疫熒光檢測。

1.2.8 細胞純度檢測

細胞純度計算：利用96孔板培養細胞，一個孔表示一個視野，計數每個孔海馬神經元的比例：每個孔海馬神經元總數/每個孔細胞總數×100%，依次得到96個值；采用Excel繪圖，直觀的看出神經元的純度百分比分布情況。

1.2.9 活性檢測

采用MTT法測定細胞活性。細胞懸液接種在96孔板上，培養不同時間點的海馬細胞，吸去培養液后，每個孔加入100～200μl 10%的MTT，培養4 h輕吸去MTT后加入等量的DMSO，在恒溫水浴振蕩器中震蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀上測定吸光度值（同時設定空白對照，即：未加入細胞）[3]。計算方法：細胞生存率=實驗組吸光度/對照組吸光度值× 100%；重復10次。

1.3 統計分析

采用SPSS19.0統計分析軟件，利用x±s計量分析。各組間比較采用單因素方差分析，用LSD法進行兩兩比較。按照α=0.05的水準判斷是否具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態觀察（如圖2）

圖2 不同時間點的細胞形態變化

2.2 NF-200、Neu-N免疫熒光鑒定和免疫組化鑒定(圖3)

圖3 海馬神經元NF-200、Neu-N鑒定

2.3 細胞純度檢測

通過倒置相差顯微鏡觀察96孔板成熟海馬神經元（胞體圓、折光性強、立體感強、突起粗大），計算海馬神經元的細胞純度(圖4)。

圖4 SD大鼠海馬細胞純度頻次分布

2.4 細胞活性情況

海馬神經元在不同時間點細胞生存率不同，從1～15 d海馬神經元生存率逐漸升高；15～17 d大概在平臺期，以后細胞生存率降低，迅速凋亡見表1。

表1 不同時間點海馬神經元活性情況

3 討論

海馬是大腦的重要結構之一，體積小、功能多樣、位置隱蔽、分層復雜，包含有古皮層（3層）和新皮層（6層），主要有椎體細胞和細顆粒細胞組成，參與大腦邊緣系統構成，在神經科學領域對于該系統的研究仍是熱點和難點之一[1]。神經系統的任務是接收、發放、處理、存儲和提取信息，這些任務都是通過其基本單位——神經細胞來完成。海馬神經元就是重要的神經元之一[4]。由于神經元是形態各異、功能復雜、化學性遞質繁多的特化細胞，這就決定了神經元培養的特殊性。由于海馬組織由神經元和非神經元構成，取材的部位不能完全準確這些原因都會影響神經元的純度。除此之外，海馬細胞原代培養還有取材來源和培養調節苛刻、步驟繁瑣、費時等情況。Neurobasal培養基是一種能滿足新生和成體腦神經元細胞培養的特殊基礎培養基，含有抑制膠質細胞生長的成分，B27是一種神經元生長及維持的添加劑，能夠代替血清中的某些成分，故聯合使用能提高神經元的純度和活性。本實驗利用成纖維細胞、膠質細胞比神經元貼壁快的原理，即差速貼壁法，能有效的提高神經元的純度。同時利用玻璃培養瓶聯合培養板培養，即細胞的保存培養：在一次取材多時，可以先讓細胞在玻璃培養瓶內生長備用，從而解決一次取材少但又要多次取材的難題。

NF-200是神經纖維絲的一種，主要表達在胞漿和突觸，參加構成神經細胞的骨架。Neu-N是一種特有的神經元DNA結合蛋白，分子質量46～48 kDa，它的功能還不是很清楚，但Soylemezoglu等研究證實：它是神經系統專有的細胞核調節分子之一[5]，它們都是海馬神經元特有的結構成分。本實驗聯合免疫熒光、免疫組化方法對神經元進行細胞核、軸突的鑒定，更具有說服力。

大部分的研究集中在動物組織層面，對于細胞及亞細胞結構的研究尚少。細胞培養的質量直接影響到研究的進展，也將影響到實驗結果的真實性和可靠性。為此，本實驗就提供了一種穩定、簡單、細胞純度和活性較高的細胞培養方法，為后續研究提供細胞基礎。

1.李云慶.Basic Neuroscience[M].北京:高等教育出版社，2010，260～261.

2.Cheng Y，Yu Lc.Galanin Protects Am yloid-β-Induced neurotoxicity on primary cultured hippocampal neurons of rats[J].Journalof Alzheimer'sDisease,2010，10:1143～1157.

3.D.L.斯佩克特,R.D.戈德曼.CellA LaboratoryManual[M].北京:科學出版社2001,953～954.

4.鄭志竑，林玲.神經細胞培養:理論與實踐[M].北京:科學出版社，2002,4～29.

5.GillSK，IshakM，RyleteRJ，etal.Exposureofnuclearantigens in form alinfixed,paraffin embedded necropsy human spinal cord tissue:Detection of NeuN[J].Journal of NeuroscienceMethods,2005,148:26～35.

（2013-06-28收稿）

Primary culturemethod of hippocam pal neurons

Xiao Xingli,Yang Chaoxian1，Gao Xiaoqing1，Chen Xiu1
Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College；1Department of Neurological Biology,Luzhou Medical College

Ob jective：To establish an effective culturemethod of hippocampalneuronsand preservable cells for the establishimentof cellmodels.Methods：SD rathippocampal neruons(born 1 day)were isolated bymechanical blow and pancreatic enzyme digestion.DMEM/F12+10%FBSsuspended hippocampalneuronswere inoculated on the glassculture vessels(1～2 days).The upper cellsuspensionwas collected，centrifugated，resuspended and inoculated on orifice plates forone day.Themedium was replaced by Neurobasal+2%B27 every 3 days.Inverted phase contrast microscopewasused toobservecellmorphologicalchangse.Hippocampusneuronalidentificationand cellactivitywere detected with immunocytochemistry and MTT.Resu lts:Hippocampal neuronswere adherent to orifice plates on the firstday.Thecellsynapsesgrew on the3th～4th day.Thecellsynapses reticulateon the11th～13th day.Thecellsgrew especially strongon the 15th～20th day and after the20th day therewas cellapoptosis.The cellsynapsewas red and nucleuswas green thatwas identified with immunofluorescent staining.The cell synapse and nucleuswere brownish yellowwith immunohistochemistry.Theneruon puritywas95%～97.5%.Thecellactivitywas thehighestin the15th～17th day（93.94%～95.13%）compared with other time growps（P＜0.01）.Conclusion:Our culturemethod is economical and can save a lot of time with simplicility and feasibity.The high purity and activity of hippocampal neuronsprovide theexperimentalbasisfor furtherstudy.

Hippocampalneurons；Primary culture；Preservablecellculture

R741

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.014

肖興莉（1987-），女，住院醫師，碩士生，E-mail:245964222@qq.com