肌筋膜經(jīng)線選穴法針刺治療對(duì)腦性癱瘓模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響①

徐冬晨，楊江，喻斌，李達(dá)玲，韓新民

肌筋膜經(jīng)線選穴法針刺治療對(duì)腦性癱瘓模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響①

徐冬晨1，楊江2，喻斌3a，李達(dá)玲3a，韓新民3b

目的 探討基于肌筋膜經(jīng)線的選穴法針刺治療對(duì)腦癱模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。方法健康21日齡雄性Sprague-Dawley大鼠20只，分成對(duì)照組、針刺1組、針刺2組和假手術(shù)組，對(duì)照組、針刺1組和針刺2組采用左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎結(jié)合低氧環(huán)境制作腦癱模型。針刺1組接受傳統(tǒng)針刺療法，針刺2組接受基于肌筋膜經(jīng)線的選穴法針刺治療。各組于針刺開始后第3、7、14天行BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)；第14天用5-溴脫氧尿核苷(BrdU)標(biāo)記檢測(cè)左腦運(yùn)動(dòng)皮層和紋狀體的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果第7天和第14天針刺2組的BBB評(píng)分恢復(fù)明顯優(yōu)于針刺1組和對(duì)照組(P＜0.01)，第3、7、14天針刺2組斜板支撐能力均較對(duì)照組升高(P≤0.05)；第14天針刺2組運(yùn)動(dòng)皮層BrdU含量較針刺1組升高(P＜0.05)。結(jié)論基于肌筋膜經(jīng)線的選穴法針刺治療能有效促進(jìn)腦癱模型神經(jīng)細(xì)胞再生和運(yùn)動(dòng)功能的改善，且優(yōu)于傳統(tǒng)針刺療法。

腦性癱瘓；肌筋膜經(jīng)線；針刺；穴位；5-溴脫氧尿核苷；運(yùn)動(dòng)功能；大鼠

[本文著錄格式]徐冬晨，楊江，喻斌，等.肌筋膜經(jīng)線選穴法針刺治療對(duì)腦性癱瘓模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(3):206-210.

針刺療法在腦癱康復(fù)治療中對(duì)運(yùn)動(dòng)功能改善的臨床療效肯定。由于針刺選穴方法以中醫(yī)理論為指導(dǎo)且多樣化，加上中樞神經(jīng)再生的復(fù)雜性，如何利用針刺更有效促進(jìn)腦癱患者運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，仍然是當(dāng)前臨床和康復(fù)治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究觀察兩種針刺療法對(duì)腦癱模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響，初步明確選穴新法的有效性和可行性，為提高針刺治療腦癱療效提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康21日齡雄性Sprague-Dawley大鼠20只，體重40～50 g，由南京江寧動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(浙)20080033。將大鼠分為4組，即假手術(shù)組、對(duì)照組、針刺1組(采用傳統(tǒng)針刺療法)和針刺2組(采用新型針刺療法)，每組5只。

1.2 主要儀器及試劑

IX71熒光倒置顯微鏡：日本OLYMPUS。5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)：南京奧生化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)ASBC3004。抗BrdU一抗：武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BM0201。羊抗鼠-FITC二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ZF-0317。DAPI染色試劑盒：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)KGA215。8%氧氣+92%氮?dú)饣旌蠚怏w：南京上元工業(yè)氣體廠。

1.3 動(dòng)物模型的建立

參照文獻(xiàn)[1]，對(duì)照組、針刺1組、針刺2組均采用左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法結(jié)合低氧環(huán)境制作腦癱模型。大鼠乙醚吸入麻醉或局麻后固定臺(tái)上，呈仰臥位。頸腹側(cè)正中切口，分離左頸總動(dòng)脈并結(jié)扎。縫合切口，青霉素注射液沖洗局部皮膚，放入37℃恒溫水浴容器中恢復(fù)2 h，然后放置密閉容器。1 L/min通入低氧氣體(8%氧氣+92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w)，2 h后取出，1 h后行行為測(cè)定。翻身不能、平衡異常和左旋者視為成功模型，返回鼠籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅切開頸部皮膚，不做結(jié)扎，余同腦癱模型。

1.4 治療方法

造模后24 h，針刺1組采取腦癱動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用處方，取患側(cè)百會(huì)、顳Ⅰ針、曲池、內(nèi)關(guān)、足三里、涌泉[2-8]。針刺2組選穴與針刺1組部位對(duì)應(yīng)，即在頭部、前肢、后肢各取2個(gè)腧穴，并根據(jù)大鼠軟癱的表現(xiàn)和由屈曲向伸展發(fā)育的規(guī)律，重點(diǎn)改善肢體伸展能力，在淺背線、上臂線之背臂線、下肢部深前線等肌筋膜經(jīng)線上初步找尋12個(gè)穴位，再利用電針刺激選擇出能以最小刺激引起系列靶肌肉收縮的穴位：絡(luò)卻、率谷、外關(guān)、肩貞、承扶、三陰交。具體定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]，結(jié)合人與大鼠骨度類比。

固定大鼠，針刺，每次留針20 min，連續(xù)針刺14 d。假手術(shù)組、對(duì)照組不進(jìn)行干預(yù)，自然恢復(fù)。第8天開始，各組每天腹腔注射BrdU 50 mg/kg。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分[10-11]各組大鼠均在針刺開始后第3、7、14天行BBB評(píng)分。將大鼠放置于寬大活動(dòng)場(chǎng)地，觀察右側(cè)后肢關(guān)節(jié)活動(dòng)的數(shù)目和范圍、負(fù)重程度及前后肢協(xié)調(diào)性、前后爪和尾部活動(dòng)情況，根據(jù)BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。

1.5.2 斜板試驗(yàn)[12]各組大鼠于針刺開始后第3、7、14天進(jìn)行斜板試驗(yàn)。將大鼠放置于自制斜板上，身體軸線與斜板縱軸垂直，將木板由0°輕輕抬起，每次升高5°，記錄大鼠能停留5 s的最大角度。

1.5.3 BrdU檢測(cè) 脫頸斷頭處死大鼠，立即取運(yùn)動(dòng)皮層和紋狀體組織，放入10%甲醛中。常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，片厚30 μm。切片60℃恒溫箱烘烤60 min；二甲苯浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min；分別用100%、95%、85%、70%乙醇浸泡各5 min；PBS洗滌5 min，共3次。放入緩沖液，煮沸20 min，浸入流水中自然冷卻；PBS洗滌5 min，共3次。3%H2O2-甲醇溶液處理切片15 min，PBS洗滌5 min，共3次；一抗1∶100稀釋后，每張切片加50 μl，37℃孵育2 h；PBS洗滌5 min，共3次。加入羊抗鼠-FITC二抗50 μl，37℃孵育30 min；PBS洗滌5 min，共5次；加DAPI染液，避光反應(yīng)5 min；PBS洗滌5 min，共5次。晾干后加防萃滅樹膠，加蓋玻片；熒光顯微鏡下觀察。綠色亮點(diǎn)為BrdU陽性染色。結(jié)果用IPP 6.0計(jì)算熒光值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BBB評(píng)分

大鼠造模術(shù)后患肢BBB評(píng)分均為0分。對(duì)照組、針刺1組、針刺2組時(shí)間主效應(yīng)不顯著(F=3.894,P= 0.143)；加入假手術(shù)組后，時(shí)間(F=25.970,P=0.000)及時(shí)間×處理方法(F=4.479,P=0.002)主效應(yīng)顯著。單因素方差分析顯示，各時(shí)間點(diǎn)組間均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)；LSD-t檢驗(yàn)，針刺開始后第3、7和14天，對(duì)照組、針刺1組、針刺2組BBB評(píng)分均顯著低于假手術(shù)組(P＜0.001)，第3天針刺1組、針刺2組、對(duì)照組兩兩之間均無顯著性差異(P＞0.05)。第7、14天BBB評(píng)分針刺2組優(yōu)于針刺1組和對(duì)照組(P＜0.01)，針刺1組與對(duì)照組無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 術(shù)后大鼠BBB評(píng)分

2.2 斜板試驗(yàn)

大鼠造模術(shù)后支撐能力明顯降低(P＜0.01)，對(duì)照組、針刺1組、針刺2組重復(fù)測(cè)量方差分析時(shí)間主效應(yīng)不顯著(F=3.858,P=0.145)；加入假手術(shù)組后，時(shí)間主效應(yīng)顯著(F=4.189,P=0.024)，時(shí)間×處理方法主效應(yīng)不顯著(F=0.818,P=0.564)。單因素方差分析顯示，各時(shí)間點(diǎn)組間均有顯著性差異(P＜0.05)；LSD-t檢驗(yàn)，針刺開始后第3、7、14天，對(duì)照組、針刺1組、針刺2組支撐能力均低于假手術(shù)組(P＜0.05)，其中針刺1組、針刺2組支撐能力均強(qiáng)于對(duì)照組(P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 術(shù)后大鼠斜板試驗(yàn)結(jié)果(°)

2.3 BrdU

對(duì)照組、針刺1組、針刺2組運(yùn)動(dòng)皮層和紋狀體BrdU熒光值均低于假手術(shù)組(P＜0.05)，針刺1組、針刺2組明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)；而針刺2組與針刺1組比較，運(yùn)動(dòng)皮層熒光值有顯著性差異(P＜0.05)，紋狀體熒光值無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖1、圖2。

圖1 皮層BrdU的表達(dá)(免疫熒光染色，200×)

圖2 紋狀體BrdU的表達(dá)(免疫熒光染色，200×)

3 討論

2001年Myers提出肌筋膜經(jīng)線，超越單一肌肉思維，建立了肌肉的整體觀念[13]，為針刺療法奠定現(xiàn)代生物學(xué)意義上的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)能學(xué)基礎(chǔ)，也為針刺療法研究擺脫傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)模式，向生物醫(yī)學(xué)模式過渡提供了理論依據(jù)，在中醫(yī)領(lǐng)域的相關(guān)研究前景廣闊。

傳統(tǒng)的針刺選穴原則包括近部選穴、遠(yuǎn)部選穴、對(duì)癥選穴；而依據(jù)肌筋膜經(jīng)線進(jìn)行選穴，是在生物學(xué)基礎(chǔ)上，根據(jù)肌筋膜經(jīng)線走向特點(diǎn)、肌筋膜分布-運(yùn)動(dòng)方向?qū)?yīng)關(guān)系，確定針刺部位、深度等，從而為穴位的篩選提供一定理論依據(jù)。對(duì)其進(jìn)行深入挖掘可能對(duì)中醫(yī)的現(xiàn)代生物學(xué)研究具有重要意義。本研究嘗試在中醫(yī)針刺領(lǐng)域初步探討基于肌筋膜經(jīng)線的選穴新法的有效性和可行性，為提高針刺治療腦癱療效提供新的思路。

幼鼠腦缺血缺氧后，部分細(xì)胞變性、壞死，出現(xiàn)典型的凋亡，神經(jīng)元增殖與分化減少[2,7,14-16]，適當(dāng)?shù)臈l件，如針刺治療[2-4,8,17]，會(huì)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生增殖、分化，并遷移到腦損傷區(qū)，參與神經(jīng)的修復(fù)過程，減輕腦部損傷，促進(jìn)功能恢復(fù)。

目前BrdU是檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用方法[18-21]。BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，能夠在細(xì)胞增殖期的DNA合成期(S期)代替胸腺嘧啶摻入到正在復(fù)制的DNA分子中，而BrdU特異性抗體可以用于檢測(cè)BrdU的摻入，從而評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。該法具有簡(jiǎn)單、迅速、直觀、敏感、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，針刺1組運(yùn)動(dòng)皮層BrdU熒光值高于針刺2組；運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)顯示，針刺2組大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)優(yōu)于針刺1組，表明基于肌筋膜經(jīng)線的選穴法對(duì)細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的促進(jìn)作用優(yōu)于傳統(tǒng)選穴方法。基于肌筋膜經(jīng)線的選穴法有效、可行，對(duì)臨床基于肌筋膜經(jīng)線選穴針刺治療腦癱提供了參考。

與傳統(tǒng)選穴方法比較，基于肌筋膜經(jīng)線的選穴新法對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖在紋狀體未見顯著性差異，顯示出腦區(qū)的特異性；在運(yùn)動(dòng)功能方面也表現(xiàn)出某些特異性，對(duì)后續(xù)研究的設(shè)計(jì)提供了新的參考。另外，基于肌筋膜經(jīng)線的選穴新法是否就可以完全取代傳統(tǒng)選穴方法，適應(yīng)范圍有多大等，本研究尚不能做出定論，仍需后續(xù)全面的深入研究。

[1]Taniguchi H,Andreasson K.The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia[J].J Vis Exp,2008,(21):955.

[2]王琴玉,孫硯輝,許能貴,等.不同時(shí)窗針刺對(duì)腦癱幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及腦組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J].針刺研究,2004,29(3):174-178.

[3]王琴玉,孫硯輝,靳瑞.不同時(shí)窗針刺對(duì)窒息腦癱幼鼠腦組織bFGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù),2005,20(4):195-197.

[4]王琴玉,王文花,靳瑞.針刺對(duì)窒息腦癱幼鼠腦組織膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2005,20(6): 423-425.

[5]劉振寰,潘佩光,趙勇,等.電針對(duì)腦性癱瘓幼鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2007,13(8): 619-620.

[6]祁巖超,劉淑華,劉振寰,等.針刺對(duì)幼鼠HIBD腦組織發(fā)育及NGF蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2008, 11(12):1-4.

[7]付強(qiáng),祁巖超,唐純志,等.針刺和神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合治療腦癱幼鼠的效果評(píng)價(jià)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(6):51-53.

[8]祁巖超,劉振寰,柴鐵劬,等.針刺抑制幼鼠HIBD腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2011,14 (15):1-4.

[9]余曙光,徐斌.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2012: 269-272.

[10]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurotrauma,1995,12(1):1-21．

[11]李曉捷,郭嵐敏.神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)和改良BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定在腦癱大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定中的應(yīng)用[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志, 2008,23(12):1067-1070.

[12]Rivlin AS,Tator CH.Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in the rat[J].J Neurosurg,1977,47(4):577-581.

[13]Myers TW.Anatomy Trains：Myofascial Meridians for Manual and Movement Therapists[M].2nd ed.New York:Churchill Livingstone,2009:1-11.

[14]李宛青,吳愛群,劉偉,等.電針治療缺血缺氧新生大鼠對(duì)海馬神經(jīng)元尼氏體的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,40 (2):271-273.

[15]黃雄昂,劉繼明,唐紹燦.電針對(duì)窒息腦癱幼鼠海馬、紋狀體和運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)GAP-43表達(dá)的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2009,47(9):44-48．

[16]吳至鳳,溫恩懿,趙聰敏,等.針刺對(duì)發(fā)育期腦損傷大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2010, 39(21):2898-2900.

[17]遲瑛嬌,李曉捷,李瑩.針刺對(duì)宮內(nèi)感染致腦損傷仔鼠腦組織膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2007, 22(15):1168-1169.

[18]Qiu L,Zhu CL,Wang XY,et al.Changes of cell proliferation and differentiation in the developing brain of mouse[J].Neurosci Bull,2007,23(1)：46-52.

[19]Takagi Y,Nozaki K,Takahashi J,et al.Proliferation of neuronal precursor cells in the dentate gyrus is accelerated after transient forebrain ischemia in mice[J].Brain Res,1999,831(1-2): 283-287.

[20]Gratzner HG.Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine:A new reagent for detection of DNA replication[J].Science,1982,218(4571)：474-475.

[21]Miller MW,Nowakowski RS.Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation，migration and time of origin of cells in the central nervous system[J]. Brain Res,1988,457(1):44-52.

Effects of Acupuncture Based on Acupoint Selection of Myofascial Meridians Perspective on Regeneration of Nerve Cells and Recovery of Motor Function in Rats with Cerebral Palsy

XU Dong-chen,YANG Jiang,YU Bin,et al.Department of Rehabilitation Science, Nanjing Technical College of Special Education,Nanjing 210000,Jiangsu,China

ObjectiveTo investigate the effects of acupuncture based on acupoint selection of myofascial meridians perspective on the regeneration of nerve cells and recovery of motor function in rats with cerebral palsy.Methods20 healthy 21-day-old male Sprague-Dawley rats were divided into control group,acupuncture groups 1(receiving traditional acupuncture)and 2(receiving acupuncture based on acupoint selection of myofascial meridians perspective),and sham group.The control group and the acupuncture groups were subjected to ligation of left carotid artery(ischemia)and then put into a hypoxic environment.They were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB) Scale and inclined plane test 3 d,7 d and 14 d after the beginning of acupuncture.And 5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)was used to label S-phase cells in the left striaturn and motor cortex in each group 14 d after the beginning of acupuncture.ResultsThe BBB scores improved more in the acupuncture group 2 than in the acupuncture group 1 and the control group 7 d,14 d after the beginning of acupuncture(P＜0.01),as well as the score of inclined plane test 3 d,7 d,14 d after acupuncture(P＜0.05).BrdU was more in the left motor cortex in the acupuncture group 2 than in the acupuncture group 1(P＜0.05).ConclusionAcupuncture based on acupoint selection of myofascial meridians perspective can promote the regeneration of nerve cells and recovery of motor function in rats with cerebral palsy,that is more effective than traditional acupuncture.

cerebral palsy;myofascial meridian;acupuncture;acupoint;5-bromodeoxyuridine;motor function;rats

R742.3

A

1006-9771(2014)03-0206-05

2013-05-23

2013-07-10)

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放課題資助項(xiàng)目(No.EZK2012011)；2.江蘇高校“青藍(lán)工程”資助項(xiàng)目。

1.南京特殊教育職業(yè)技術(shù)學(xué)院康復(fù)科學(xué)系，江蘇南京市210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京市210000；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，a.藥學(xué)院；b.第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京市210000。作者簡(jiǎn)介：徐冬晨(1977-)，男，江蘇江陰市人，碩士，副教授，主要研究方向：兒童康復(fù)。通訊作者：韓新民。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.03.002