低頻電針對脊神經結扎大鼠痛敏化的干預作用①

蔣永亮，尹小虎，沈亞芳，趙曉蕓，何曉芬，方劍喬

低頻電針對脊神經結扎大鼠痛敏化的干預作用①

蔣永亮，尹小虎，沈亞芳，趙曉蕓，何曉芬，方劍喬

目的 觀察低頻電針對脊神經結扎神經病理痛大鼠模型痛敏化的干預作用，探討其可能的外周痛敏化調節機制。方法建立大鼠L5脊神經結扎模型，電針足三里和昆侖穴，觀察大鼠痛覺超敏反應，運用Western blotting法檢測L4、L5背根神經節(DRG)辣椒素受體(TRPV1)與P物質(SP)水平，采用TRPV1激動劑6'-IRTX進行驗證。結果脊神經結扎大鼠出現明顯的痛敏化反應，術側L4DRG TRPV1和L5DRG SP水平升高(P＜0.05)；低頻電針能減輕模型大鼠的痛敏反應，抑制TRPV1、SP水平上升(P＜0.05)。6'-IRTX腹腔注射能拮抗低頻電針的抗痛敏化作用。結論低頻電針可減輕痛敏化，發揮對神經病理痛的治療作用，其機制可能與其有效調控DRG TRPV1和SP有關。

神經病理痛；電針；背根神經節；辣椒素受體；P物質

[本文著錄格式]蔣永亮，尹小虎，沈亞芳，等.低頻電針對脊神經結扎大鼠痛敏化的干預作用[J].中國康復理論與實踐, 2014,20(3):211-214.

神經病理痛是由軀體感覺神經系統損傷或病變直接引起的疼痛綜合征，主要表現為自發性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏，臨床上常見、多發、難治，如脊髓、外周神經損傷所致神經痛，腦卒中后遺痛，皰疹后遺痛等，是疼痛醫學與康復醫學領域的棘手問題[1-2]。藥物治療神經病理痛存在療效不佳、治療缺乏針對性、毒副作用大等問題，探尋療效好、副作用少的非藥物療法是當前神經病理痛治療與康復的一個重要方向[3]。

大量基礎與臨床研究表明，針灸對慢性疼痛具有良好的療效，針刺治療慢性炎性痛的抗炎鎮痛機制和中樞阿片機制業已清楚，極大地促進了世界范圍內針刺治療炎性痛的應用[4]。有研究表明，電針對神經病理痛也有治療作用，且低頻電針的療效好于高頻電針[5]。這種作用不被納洛酮阻斷[6]，表明電針干預神經病理痛存在非阿片機制。

痛覺敏化的外周機制，即初級痛覺神經元的超興奮性，是神經病理痛的一個重要機制，涉及多種離子通道、受體、神經遞質在背根神經節(dorsal root ganglion,DRG)神經元上的變化[7]。辣椒素受體(transientreceptor potential vanilloid type 1,TRPV1)與疼痛信號的產生、傳遞與調節密切相關，DRG神經元TRPV1在神經病理痛痛敏化中起著重要作用。P物質(substance P,SP)是一種重要的神經肽，釋放后能進一步促進痛覺敏化[8]。

本研究建立L5脊神經結扎(spinal nerve ligation, SNL)神經病理痛大鼠模型，觀察低頻電針對痛覺超敏反應、DRG TRPV1與SP表達水平的影響。進一步行TRPV1激動劑6'-IRTX對低頻電針作用的影響的驗證性實驗，以明確低頻電針治療神經病理痛是否存在抑制痛敏化的過程，是否與有效干預DRG TRPV1和SP有關。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用健康雄性SD大鼠32只，體重(200±10)g，購于中國科學院上海實驗動物中心[SCXK(滬)2008-0016]，由浙江中醫藥大學實驗動物中心飼養。

1.2 主要試劑與藥物

華佗牌無菌針灸針0.25×13 mm：蘇州醫療用品廠有限公司；韓氏穴位神經刺激儀：北京華衛產業開發公司；動態足底測量儀：意大利UGO BASILE公司；凝膠成像儀：日本FUJI FILM公司；美國綿羊多克隆抗體TRPV1抗體：美國ABCAM公司；山羊多克隆抗體Substance P抗體：美國SANTA CRUZ公司；小鼠單克隆抗體β-actin抗體：上海康成生物工程有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、超敏ECL化學發光試劑盒：碧云天公司；蛋白酶抑制劑Cocktail：生工生物工程(上海)股份有限公司；TRPV1激動劑6'-IRTX：美國SIGMA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模 將大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、電針組，每組8只。

按照Kim和Chung[9]的方法建立L5SNL神經病理痛大鼠模型。大鼠稱重后，用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔麻醉。大鼠俯臥位放置在手術臺上，腰部去毛，備皮。在脊柱右側旁開0.5 cm處，沿L3～S2垂直切開背部皮膚，鈍性分離右側椎旁肌肉，暴露L4～S2橫突。用小咬骨鉗小心咬除L5橫突，暴露、分離L5脊神經，用6/0絲線緊緊結扎。逐層縫合切口，并在術側(右側)大腿注射青霉素預防感染。假手術組操作與手術組相同，但不結扎神經。

1.3.2 治療方法 造模后第3天開始治療。電針組取患側足三里(ST36)、昆侖穴(BL60)，定位參照華興邦大鼠穴位圖譜。將大鼠固定在特制的布套里，雙后肢、尾巴暴露在外。扎入不銹鋼針灸針，用韓氏穴位神經刺激儀給予電刺激，治療參數：頻率2 Hz，強度1 mA 15 min，2 mA 15 min，共30 min。隔日1次，共7次。正常組、模型組、假手術組大鼠不做治療，給予與電針組相同固定。

1.4 痛覺超敏反應檢測

采用動態足底測量儀檢測大鼠術側后足縮腿閾(paw withdrawal threshold,PWT)。將大鼠置鐵絲網上11.5×17×14 cm透明塑料盒內30 min適應環境。待大鼠安靜后(停止梳理毛發和探索性活動)，將連在機械泵上類Von Frey絲的金屬絲(直徑0.5 mm)置于大鼠后足中央，避開足墊；啟動機械泵，金屬絲以恒定速度自動上臺，對大鼠足底施加機械刺激。刺激強度從0開始以2.5 g/s遞增，直至大鼠產生縮腿反應；最大刺激強度50 g。連續測量3次，取平均值，每次間隔5 min。分別于造模前(基礎痛閾)和造模后第1天、造模后第3天、造模后第15天4個時間點測量。

1.5 Western blotting檢測

于造模后第15天將大鼠用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔麻醉，小心剪開胸腔，暴露心臟。剪開右心室，經左心室灌注生理鹽水。大鼠處死后，冰上立即取出術側L4-5DRG，迅速放入-80℃冰箱保存。DRG放入2 ml EP管中稱重，加入預冷的裂解液RIPA 100 μl/10 mg新鮮組織、蛋白酶抑制劑Cocktail 1 μl/100 μl RIPA。冰上充分超聲粉碎。4℃冰箱靜置30 min，低溫10000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白濃度，計算上樣量為30 μg所需的總蛋白量。總蛋白與2倍上樣緩沖液等比例稀釋，100℃水浴變性10 min。

TRPV1用8%SDS-PAGE分離膠，SP采用15% SDS-PAGE分離膠；濃縮膠用5%SDS-PAGE。電泳：濃縮膠電壓80 V，30 min；分離膠電壓120 V，90 min，分離蛋白。電泳后分別用0.45 μm和0.22 μm PVDF膜進行轉膜；條帶在5%脫脂奶粉中封閉2 h；分別用綿羊多克隆抗TRPV1抗體(1∶2000)、山羊多克隆抗SP抗體(1∶500)和小鼠單克隆抗β-actin抗體(1∶10000)，4℃冰箱孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。所得的印跡室溫下與相應的辣根過氧化物酶(HRP)結合的二抗孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；用ECL顯色液反應1 min，濾去顯色液，凝膠成像儀拍片。Image Quant TL軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.6 6 '-IRTX驗證實驗

大鼠隨機分為低頻電針+生理鹽水組和低頻電針+ 6'-IRTX組，每組8只。造模、低頻電針治療方法同前。低頻電針+生理鹽水組與低頻電針+6'-IRTX組在造模后第15天電針干預前分別腹腔注射生理鹽水1 ml和6'-IRTX 0.001 mg/kg(95%乙醇稀釋，用生理鹽水補足到1 ml)。分別于造模前(基礎痛閾)和造模后第1天、造模后第3天、造模后第15天4個時間點測量PWT。

1.7 統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，數據用(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，組間兩兩比較采用post hoc LSD檢驗。6'-IRTX驗證實驗采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 PWT

各組大鼠造模前PWT無顯著性差異(P＞0.05)。造模后第1天，模型組大鼠出現抬腳、舔足等自發性疼痛與痛覺超敏現象，PWT顯著低于正常組和假手術組(P＜0.001)，一直持續到造模后第15天。假手術組與正常組PWT無顯著性差異(P＞0.05)。電針組造模后第15天PWT顯著高于模型組(P＜0.001)。見表1。

2.2 TRPV1

造模后第15天，模型組大鼠術側L5DRG TRPV1水平明顯低于正常組(P＜0.01)，而L4DRG TRPV1升高(P＜0.05)；與模型組比較，電針組L4DRG TRPV1水平顯著下降(P＜0.001)，L5DRG TRPV1水平無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1。

2.3 SP

造模后第15天，模型組大鼠術側L5DRG SP水平高于正常組(P＜0.05)，L4DRG SP水平無顯著性差異(P＞0.05)；與模型組比較，電針組L5DRG SP水平顯著下降(P＜0.001)，L4DRG SP水平無顯著性差異(P＞0.05)。見圖2。

2.4 6 '-IRTX對低頻電針抗痛敏化作用的影響

造模后第15天，低頻電針+6'-IRTX組PWT顯著低于低頻電針+生理鹽水組(P＜0.001)。見表2。

圖1 造模后第15天各組DRG TRPV1水平比較

圖2 造模后第15天各組DRG SP水平比較

表1 各組各時間點PWT比較(g)

表2 驗證實驗各組各時間點PWT比較(g)

3 討論

TRPV1是TRPs超家族中與炎性痛和神經病理痛均密切相關的成員[10]，在外周主要分布于較細的DRG神經元、C纖維和Aδ纖維[11-12]，與痛敏化相關[13]。在SNL損傷的DRG神經元中，TRPV1上調，與SNL誘導的神經病理痛有關[14]。本研究顯示，SNL神經痛大鼠完整的L4DRG中，TRPV1出現上調；而結扎損傷的L5DRG中，TRPV1卻出現下調。其確切機制有待進一步明確。

低頻電針能顯著降低上調的L4DRG TRPV1；TRPV1激動劑6'-IRTX腹腔注射，能顯著拮抗低頻電針抗痛敏化的作用。表明低頻電針可通過調控TRPV1干預痛敏化。

SP最初從馬的大腦和腸提取物中分離，是一種由11個氨基酸構成的神經肽。SP主要在DRG神經元中合成，通過軸流轉運向上可至脊髓背角，向下可至感覺神經末梢。與TRPV1一樣選擇性表達于感受傷害性信息的中小感覺神經元，是一種從外周到中樞神經系統傳送痛覺沖動的主要炎性神經肽[10]。神經損傷后，C纖維興奮性增加，SP大量釋放，促進痛覺敏化[8]。本研究顯示，SNL大鼠損傷的L5DRG中，SP顯著上升；低頻電針能有效抑制SP上升。這也可能與低頻電針干預神經病理痛痛敏化有關。

TRPV1激活能促使DRG神經元釋放SP，進一步促進痛覺敏化[8]。本研究顯示，損傷的L5DRG中TRPV1水平下降，SP水平上升。SP的釋放與TRPV1有何關系，是否還與其他痛敏化相關受體、離子通道的激活有關，有待進一步明確。

本研究行為學實驗表明，SNL大鼠早期出現痛覺超敏反應；低頻電針能顯著改善痛敏化程度。

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Effect of Electroacupuncture with Low Frequency on Pain Sensitization of Rats Suffered from Spinal Nerve Ligation

JIANG Yongliang,YIN Xiao-hu,SHEN Ya-fang,et al.Department of Neurobiology and Acupuncture Research,the Third Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,Zhejiang,China

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture with low frequency on pain sensitization of neuropathic pain rats, and the possible mechanism of regulating peripheral pain sensitization.MethodsRat neuropathic pain model was established with the right L5spinal nerve ligation.Zusanli(ST36)and Kunlun(BL60)were selected for electroacupuncture intervention.Mechanical allodynia,and the levels of stransient receptor potential vanilloid type 1(TRPV1)and substance P(SP)in ipsilateral L5and L4dorsal root ganglion(DRG) were tested.A further validation experiment with TRPV1 agonist 6'-IRTX was carried out.ResultsRats suffered from L5spinal nerve ligation showed obvious pain sensitization.The levels of TRPV1 in ipsilateral L4DRG and SP in ipsilateral L5DRG were significantly elevated. Electroacupuncture with low frequency significantly relieved pain sensitization,and suppressed TRPV1 and SP increase.6'-IRTX intraperitoneally administered significantly counteracted the anti-pain sensitization action of electroacupuncture with low frequency.ConclusionElectroacupuncture with low frequency is effective on neuropathic pain by intervening pain sensitization,which may be related to the regulation of DRG TRPV1 and SP.

neuropathic pain;electroacupuncture;dorsal root ganglion;transient receptor potential vanilloid type l;substance P

R745.4

A

1006-9771(2014)03-0211-04

2013-09-26

2014-01-23)

1.國家自然科學基金項目(No.81072855)；2.浙江省自然科學基金項目(No.LY12H27015;No.Z2100979)。

浙江中醫藥大學第三臨床醫學院針灸神經生物學實驗室，浙江杭州市310053。作者簡介：蔣永亮(1981-)，男，浙江磐安縣人，博士，助理研究員，主要研究方向：針刺鎮痛與免疫調節的相關性研究。并列第一作者：尹小虎。通訊作者：方劍喬(1961-)，男，博士，教授，博士生導師。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.03.003