電針對兔腰肌急性鈍挫傷后組織修復與堿性成纖維細胞生長因子/細胞外信號調節激酶信號通路的影響①

陳歡，彭博，李富運，于雪，盧虎英，衛肖艷，彭園園，范伊凡，張莉

電針對兔腰肌急性鈍挫傷后組織修復與堿性成纖維細胞生長因子/細胞外信號調節激酶信號通路的影響①

陳歡1，彭博1，李富運1，于雪2，盧虎英3，衛肖艷1，彭園園1，范伊凡1，張莉1

目的 觀察電針對兔腰肌急性鈍挫傷后堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、結蛋白(Desmin)以及細胞外信號調節激酶(ERK1/2)表達的影響，探討電針對兔腰肌損傷后組織再生修復影響的可能機制。方法40只雄性新西蘭大耳兔隨機分為空白組、模型組、電針委中組、電針局部組，每組10只。采用鈍挫傷方法造成兔腰肌損傷模型并對各組動物進行外表觀察評分。造模后電針治療2周，HE染色觀察腰肌組織形態改變，免疫組化染色觀察腰肌bFGF的表達，Western blotting法檢測腰肌Desmin與ERK1/2蛋白表達。結果模型組、電針委中組與電針局部組外表觀察評分均明顯高于空白組(P＜0.01)。組織形態學評分由高到低依次為模型組、電針局部組、電針委中組、空白組(P＜0.05)，腰肌bFGF的表達依次為電針局部組、電針委中組、模型組、空白組，Desmin的表達為電針局部組=電針委中組、空白組=模型組(P＜0.05)，ERK1/2的表達為電針局部組=電針委中組、模型組、空白組(P＜0.05)。結論電針可能通過上調bFGF/ERK信號通路的表達，促進兔腰肌急性鈍挫傷后的組織修復。

腰肌急性鈍挫傷；電針；委中；堿性成纖維細胞生長因子；結蛋白；細胞外信號調節激酶；兔

[本文著錄格式]陳歡，彭博，李富運，等.電針對兔腰肌急性鈍挫傷后組織修復與堿性成纖維細胞生長因子/細胞外信號調節激酶信號通路的影響[J].中國康復理論與實踐,2014,20(3):215-220.

“腰背委中求”是指導針灸臨床的經典理論依據之一。臨床經驗與實驗研究均表明，委中穴(BL40)對腰背部疾病具有很好的療效[1-2]。電針阿是穴能夠促進骨骼肌損傷后肌肉的再生與修復，并且與上調堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表達有關[3]。bFGF激活的細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)信號通路是調節細胞增殖與分化的主要細胞外信號通路之一[4-5]。本研究觀察電針委中穴與局部對損傷組織的再生修復作用，以及對bFGF/ERK信號通路的影響，探討委中穴對腰背部疾病的作用機制，以期揭示“腰背委中求”的部分科學內涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年雄性新西蘭大耳兔40只，體重2.0～2.5 kg，由北京市興隆實驗動物養殖廠提供，許可證號：SCXK(京)2011-0006。

1.1.2 儀器 G6805-1電針治療儀：青島鑫升實業有限公司。RM2235石蠟切片機：德國LEICA MICROSYSTEMS公司。DH-101電熱恒溫鼓風干燥箱：北京利康科技發展有限公司。BX43顯微鏡：日本OLYMPUS公司。Mshot MC50顯微成像系統：廣州市明美科技有限公司。Thermo Scientific Forma 907超低溫冰箱：THERMO SCIENTIFIC公司。Sigma?3K30高速離心機：SIGMA公司。3 ml、5 ml玻璃勻漿器：海門弘澄實驗器材制造有限公司。FA1004N電子天平：上海精密科學儀器有限公司。SPX型智能生化培養箱：寧波江南儀器廠。Bio-Rad?蛋白質電泳及轉膜系統：BIO-RAD公司。IKA?RH Basic 1恒溫磁力攪拌器：IKA公司。TS-1搖床：北京泰亞賽福科技發展有限責任公司。Tecan?Austria GMbH全波長多功能酶標儀：TECAN公司。Alpha Innotech?Fluor Chem FC2凝膠成像系統：ALPHAINNOTECH。

1.1.3 試劑 兔多抗FGF-2抗體、兔多抗ERK1/2抗體、兔多抗結蛋白(Desmin)抗體、鼠多抗GADPH抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠HRP二抗：北京博奧森生物技術有限公司。通用型二抗、DAB顯色劑：北京中杉金橋生物技術有限公司。E040252 MarkerⅠ：EarthOx公司。RIPA裂解緩沖液、蛋白定量試劑盒、PVDF膜：北京普利萊基因技術有限公司。Pierce ECL蛋白印跡發光底物：THERMO公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 按隨機數字法分為空白組、模型組、電針委中組、電針局部組，每組10只。

1.2.2 動物造模 模型組、電針委中組、電針局部組適應性喂養后，20%烏拉坦溶液5 ml/kg腹腔注射麻醉。麻醉后固定于兔臺上，剪除第5腰椎水平兩側腰部被毛，面積約為4×4 cm，用48 cm高的導向筒固定高度和打擊點，以500 g砝碼從導向筒中自由落下，重力勢能為2.352 J，反復30次，損傷面的面積約2×2 cm，依次造成雙側腰肌急性鈍挫傷[6]。造模完成后10 min，觀察左右側局部外表形態學變化并進行外表觀察評分[7](表1)。取兩側平均值。

表1 外表觀察評分標準

1.2.3 處理方法 ①空白組：不做任何處理。②模型組：與電針委中組、電針局部組同步抓取與固定，不做治療；③電針委中組：參照《實驗針灸學》常用實驗動物穴位圖譜選取委中穴，0.25×13 mm一次性針灸針(中研太和)，接電針治療儀，頻率2/10 Hz疏密波，電流1～2 mA，持續20 min，每天1次，每周6次，共2周。④電針局部組：以打擊病損中心為電針作用點，刺激參數同電針委中組。造模后第2天開始治療。

1.2.4 取材 造模治療2周后，各組動物20%烏拉坦溶液5 ml/kg腹腔注射麻醉。無菌操作，剔除皮毛、筋膜，暴露分離出下腰部肌肉，銳性切取左側第5腰椎水平病灶組織，寬、厚約1.5 cm。置4%多聚甲醛溶液固定；銳性切取右側第5腰椎水平的病灶組織，迅速轉移至2 ml凍存管并投入液氮罐中快速降溫，轉移至-80℃冰箱保存，待測。

1.2.5 HE染色 4%多聚甲醛溶液固定48 h以上，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下(200×)利用無偏體視學(unbiased stereology)技術，全視野無偏采樣方法每張切片選取6個視野，進行組織形態學評分[7](表2)。

表2 組織形態學評分標準

1.2.6 免疫組化染色 65℃烤片6 h，常規二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，雙蒸水沖洗以封閉內源性過氧化氫酶，沖洗、熱修復抗原，PBS沖洗封閉，4℃孵育14 h，加Ⅰ抗、Ⅱ抗，DAB顯色，顯微鏡下觀察，出現棕黃色后即把切片放入自來水中終止反應。自來水沖洗，蘇木素復染，鹽酸酒精、氨水返藍，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、采集圖像，采用Image-professional Plus 6.0軟件進行圖像分析。光鏡下(200×)利用無偏體視學技術，全視野無偏采樣方法每張切片選取7個視野，測量每個視野中bFGF陽性表達區域的平均光密度值(mean optical density, MOD)，取平均值為該樣本MOD值。

1.2.7 Western blotting 取好的組織分別置于2 ml蛋白裂解液中低溫勻漿。12,000 r/min 4℃離心10 min，取上清液。取上清液10 μl，BCA法測蛋白含量(參照試劑盒說明進行)，繪制標準曲線。在樣品中按4∶1加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min后放入冰中迅速降溫。SDS-PAGE電泳：每孔上樣10 μl(含蛋白液2 μl)，最后留1孔加入Marker 8 μl，接通電泳裝置，100 V，48 mA電泳約90 min，以肉眼觀察溴酚藍條帶距膠底1 cm左右停止電泳。根據目標蛋白ERK1/2 (42 kDa)與Desmin(52 kDa)分子量，按Marker條帶分布切取需要電轉的膠。在轉移緩沖液中，按從負極面到正極面，按海綿、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙、海綿的順序重疊，移入已置有冰盒的轉移緩沖液中，以100 V電壓冰浴中電轉75 min。PBST洗膜10 min，共3次，加入封閉液37℃搖床封閉90 min。PBST洗膜10 min，共3次，加入一抗(PBS溶液1∶300稀釋)，室溫孵育90 min；PBST洗膜10 min，共3次，加入二抗(PBS溶液1∶10000稀釋)，室溫孵育60 min；PBST洗膜10 min，共4次。將ECL底物顯色A、B液以1∶1混合，膜正面向上，加入混合液室溫反應正面2 min，背面30 s，放進膠片夾中曝光，X光片置于顯影液顯影，最后置于定影液中定影。

內參GADPH的蛋白印記：將完成ERK1/2與Desmin蛋白印記的膜PBST洗膜10 min，共3次，再置于膜再生液中再生20 min，PBST洗膜5 min，共2次。抗原抗體反應過程中GADPH以PBS溶液1∶500稀釋，二抗以PBS溶液1∶8000稀釋。

X光片采用Alpha Innotech?Fluor Chem FC2凝膠成像系統進行圖像采集，使用AlphaEasy FC軟件對圖像進行定量分析，計算每個樣本的ERK1/2、Desmin與GADPH的光密度比值(IDV)。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理。各組數據以(±s)表示。組間采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較用LSD-t檢驗。顯著性水平α1=0.05，非常顯著性水平α2=0.01。

2 結果

2.1 外表觀察評分

造模后模型組、電針委中組與電針局部組之間外表觀察評分無顯著性差異(P＞0.05)，并均明顯高于空白組(P＜0.01)。見表3。

表3 兔腰肌外表觀察評分

2.2 組織形態學變化

空白組：肌細胞呈規則多邊形，大小均勻，排列整齊，肌纖維間隙大小一致，細胞核位于細胞邊緣，且每個肌細胞可見到幾個細胞核排列。模型組：肌細胞形狀、大小不規則，排列不齊，損傷局部出現大量結締組織增生，以及少量細胞核位于中心的新生的肌細胞。電針委中組：肌纖維排列較模型組整齊，肌細胞稍腫脹，可能與肌細胞再生分化有關，結締組織增生程度較模型組輕。電針局部組：肌纖維排列較模型組整齊，中心核的新生肌細胞較多，肌細胞體積略小于電針委中組，可見輕度結締組織增生現象。見圖1。

模型組組織形態學評分明顯高于空白組，電針委中組與電針局部組評分明顯低于模型組(P＜0.01)，電針委中組低于電針局部組(P＜0.05)。見表4。

表4 兔腰肌組織形態學評分

2.3 bFGF

空白組：bFGF呈淺黃色的弱陽性表達，略高于背景，分布均勻。模型組：骨骼肌損傷局部出現黃色的bFGF陽性表達。電針委中組：bFGF呈棕色的強陽性表達。電針局部組：bFGF呈棕色的強陽性表達，與電針委中組比較表達強度相當，但陽性表達面積較多。見圖2。

圖像分析顯示，模型組bFGF表達明顯高于空白組(P＜0.01)，電針委中組與電針局部組明顯高于模型組(P＜0.01)，電針局部組明顯高于電針委中組(P＜0.01)。見表5。

2.4 Desmin

模型組腰肌Desmin表達與空白組無顯著性差異(P＞0.05)，電針委中組和電針局部組的表達均高于空白組(P＜0.05)和模型組(P＜0.05)，電針委中組與電針局部組無顯著性差異(P＞0.05)。見表6。

2.5 ERK1/2

模型組腰肌ERK1/2的表達高于空白組(P＜0.05)，電針委中組和電針局部組的表達均高于空白組(P＜0.01)和模型組(P＜0.05)，電針委中組與電針局部組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表7。

表5 兔腰肌bFGF的表達

圖1 各組兔腰肌組織形態學變化(HE染色，200×)

圖2 各組兔腰肌bFGF表達(免疫組化，200×）

表6 兔腰肌Desmin表達

表7 兔腰肌ERK1/2表達

3 討論

《靈樞》“以痛為腧”的思想被廣泛應用于治療各種急慢性筋傷、筋損病癥。針刺局部阿是穴能夠改善骨骼肌損傷后肌原纖維和肌節的排列，抑制組織纖維化，促進組織形態學的恢復[8-9]。

“經脈所過，主治所及”是遠端循經取穴的理論依據。遠端腧穴能夠通過疏通經絡，運行氣血對經脈所過部位產生濡養作用。

委中穴是足太陽膀胱經的合穴，腰背部為膀胱經循行之要道。委中穴與腰背部組織存在神經特異性聯系，對腰背部疾病療效顯著[1-2]。本研究結果顯示，與模型組比較，電針局部組和電針委中組肌纖維排列均較整齊，肌細胞大小形態較規則，并且可見較多新生的肌纖維，結締組織增生現象較輕，組織形態學評分顯著高于模型組，組織修復程度優于模型組。電針委中組的病灶區域少于電針局部組，肌細胞體積較大；電針局部組可見較多新生肌細胞，提示電針局部組部分病灶仍處于肌細胞再生階段，而電針委中組已進入成肌分化階段。組織形態學評分顯示電針委中組優于電針局部組。提示在急性鈍挫傷中，遠端循經取穴能較好促進損傷組織形態的恢復。這可能是因為遠端穴位刺激除了能夠較好維持損傷腰肌的局部制動，同時又能夠疏經通絡，調理氣血，調節經脈循行之處腰背部組織的代謝，從而對損傷修復產生較好的調節作用。

Desmin是一種肌肉特異性中間絲蛋白，在骨骼肌成肌分化過程中較早表達[10]。Desmin在正常肌纖維中有分布；肌肉損傷后由于骨架蛋白的缺失，導致Desmin表達迅速下降；隨著肌衛星細胞再生分化為具有肌肉特性的肌纖維后，Desmin表達增加，隨后可逐漸回落到正常水平或造成永久缺失[3,11]。骨骼肌損傷后經歷壞死/炎癥、修復與重塑3個病理階段，損傷后第2周處于組織修復高峰期[12-13]。本研究結果顯示，此時模型組Desmin表達與空白組無顯著性差異，結合組織形態學結果，此時模型組正處于組織再生修復階段；電針委中穴與電針局部均能夠促進兔腰肌鈍挫傷后再生肌細胞向成肌分化。

促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是哺乳動物體內維持細胞生長、增殖、分化、存活以及先天免疫的一系列重要細胞內信號通路[14]。ERK1/2是MAPK信號通路中的一個子通路，具有調節細胞有絲分裂和促有絲分裂的功能，在促進細胞增殖、分化與轉化中發揮主要作用[15]。

bFGF是一類對成纖維細胞系Balb/c3T3的分裂增殖具有促進效應的多肽，對骨骼肌損傷后肌衛星細胞的激活與成肌分化具有較好的促進作用[16-17]。骨骼肌損傷后，由于肌細胞膜破裂，bFGF釋放到病灶局部[18]；另一方面，機體損傷信號的刺激可上調bFGF的分泌，從而共同參與肌細胞的再生與分化。bFGF受體屬于RKT家族，能通過Ras/Raf-1/MEKs級聯途徑激活ERK1/2信號通路，從而促進肌衛星細胞的細胞增殖與分化[4-5]。

本研究結果顯示，兔腰肌鈍挫傷2周后，腰肌bFGF與ERK1/2的表達均出現上調；電針委中穴與電針局部均能使機體bFGF與ERK1/2的表達增加，其中電針局部組腰肌bFGF的表達高于電針委中組，這可能與電針對肌纖維的直接牽拉有關。雖然電針局部組bFGF表達高于電針委中組，但是組織形態學恢復卻不如電針委中組。邵素霞等發現，在一定范圍內隨著bFGF濃度的增加，體外培養的骨骼肌衛星細胞的增殖能力有所上升，但是這種促進能力并不隨著濃度的持續上升而無限增大，bFGF在促進離體肌衛星細胞增殖存在著一個最佳濃度范圍[19]。機體局部分泌的bFGF對促組織修復可能也存在一個最佳濃度范圍。

兔腰肌鈍挫傷后會產生組織的再生與修復，損傷局部的骨骼肌可能通過bFGF的自分泌，激活ERK1/2信號通路，從而促進骨骼肌的自我修復。電針委中穴與電針局部均能夠促進兔腰肌鈍挫傷后的組織再生與修復，其機制可能與上調bFGF/ERK信號通路的表達有關。

[1]余維豪,范維銘,蔡虹,等.“腰背委中求”的臨床與機理研究[J].中國針灸,1997,17(8):503-504.

[2]卜玉,孫忠人.委中剌血配合針刺治療背肌筋膜炎臨床療效觀察[J].針灸臨床雜志,2012,28(5):32.

[3]陳歡,張莉,崔強,等.電針阿是穴對骨骼肌損傷大鼠肌肉再生及堿性成纖維細胞生長因子表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2013,19 (4):334-340.

[4]Sangaj N,Kyriakakis P,Yang D,et al.Heparin mimicking polymer promotes myogenic differentiation of muscle progenitor cells[J].Biomacromolecules,2010,11(12):3294-3300.

[5]Jump SS,Childs TE,Zwetsloot KA,et al.Fibroblast growth factor 2-stimulated proliferation is lower in muscle precursor cells from old rats[J].Exp Phys,2009,94(6):739-748.

[6]周忠群,盧振和,高崇榮.射頻熱凝治療兔慢性軟組織損傷的實驗研究[J].中國疼痛醫學雜志,2008,14(5):298-301.

[7]周國林,姚全勝,潘玉英.一種動物軟組織損傷的實驗方法[J].中國藥理學通報,1991,7(5):396-398.

[8]李俊華,王正珍,唐云峰,等.針刺對大鼠骨骼肌挫傷后肌肉再生的影響[J].北京體育大學學報,2012,35(6):61-65.

[9]Wang R,Luo D,Xiao C,et al.The time course effects of electroacupuncture on promoting skeletal muscle regeneration and inhibiting excessive fibrosis after contusion in rabbits[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:869398

[10]Portilho DM,Soares CP,Morrot A,et al.Cholesterol depletion by methyl-β-cyclodextrin enhances cell proliferation and increases the number of desmin-positive cells in myoblast cultures[J].Eur J Pharmacol,2012,694(1-3):1-12.

[11]Vaittinen S,Lukka R,Sahlgren C,et al.The expression of intermediate filament protein nestin as related to vimentin and desmin in regenerating skeletal muscle[J].J Neuropathol Exp Neurol,2001,60(6):588-597.

[12]Turner NJ,Badylak SF.Regeneration of skeletal muscle[J].Cell Tissue Res,2012,347(3):759-774.

[13]J?rvinen TAH,J?rvinen TLN,K??ri?inen M,et al.Muscle injuries biology and treatment[J].Am J Sports Med,2005,33(5):745-764.

[14]Plotnikov A,Zehorai E,Procaccia S,et al.The MAPK cascades:signaling components,nuclear roles and mechanisms of nuclear translocation[J].Biochim BiophysActa,2011,1813(9):1619-1633.

[15]Johnson GL,Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK,JNK,and p38 protein kinases[J].Science,2002,298 (5600):1911-1912.

[16]Anderson JE,Mitchell CM,McGeachie JK,et al.The time course of basic fibroblast growth factor expression in crush-injured skeletal muscles of SJL/J and BALB/c mice[J].Exp Cell Res,1995,216(2):325-334.

[17]Do MKQ,Suzuki T,Gerelt B,et al.Time-coordinated prevalence of extracellular HGF,FGF2 and TGF-β3 in crush-injured skeletal muscle[J].Animal Sci J,2012,83(10):712-717.

[18]Clarke MS,Khakee R,McNeil PL.Loss of cytoplasmic basic fibroblast growth factor from physiologically wounded myofibers of normal and dystrophic muscle[J].J Cell Sci,1993,106(1):121-133.

[19]邵素霞,馬洪駿,趙春芳,等.EGF,bFGF和PHGF對大鼠骨骼肌衛星細胞增殖的影響[J].細胞生物學雜志,2004,26(4):425-428.

Effects of Electroacupuncture on Morphology Repairment and Basic Fibroblast Growth Factor/Extracellular Signal-regulated Kinase Signal Pathway of Rabbits with Acute Lumbar Muscle Contusion

CHEN Huan,PENG Bo,LI Fu-yun,et al.Acupuncture Moxibusion and Tuina School,Beijing University of Chinese Medcine,Beijing 100029,China

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture on basic fibroblast growth factor(bFGF),Desmin and extracellular signal-regulated kinase(ERK1/2)expression of rabbits with acute lumbar muscle contusion,and discuss the possible mechanism of muscle tissue regeneration and repair.Methods40 male New Zealand rabbits were randomly divided into blank group(BG,n=10),model group (MG,n=10),Weizhong(BL40)electroacupuncture group(WG,n=10)and local electroacupuncture group(LG,n=10).Lumbar muscle injury was established with blunt trauma,and the rabbits were assessed with Appearance Score.The WG and LG accepted electroacupuncture for 2 weeks after modeling.The lumbar muscle of each animal was stained with HE to observe pathological changes,and immunohistochemical staining was used to observe bFGF expression,and Western blotting was used to detect the expression of Desmin and ERK1/2 protein.ResultsAppearance Score was more in the MG,WG and LG than in the BG(P＜0.01).Histological score ranked from more to less as MG, LG,WG and BG(P＜0.05).The expression of bFGF ranked as LG,WG,MG and BG(P＜0.01),Desmin ranked as WG=LG and BG=MG(P＜0.05),ERK1/2 as LG=WG,MG and BG(P＜0.05).ConclusionElectroacupuncture could promote the regeneration and repair of tissue after acute lumbar muscle contusion,which may be related to the up-regulation of bFGF/ERK signaling pathway.

lumbar acute contusion;electroacupuncture;BL40;basic fibroblast growth factor;Desmin;extracellular signal-regulated protein kinase;rabbits

R685.4

A

1006-9771(2014)03-0215-06

2013-08-09

2013-10-08)

1.國家自然科學基金項目(No.81141120)；2.高等學校博士學科點專項科研基金項目(No.20110013110014)。

1.北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京市100029；2.北京中醫藥大學基礎醫學院科研實驗中心，北京市100029；3.中國康復研究中心，北京市100068。作者簡介：陳歡(1984-)，女，福建漳州市人，博士研究生，主要研究方向：針灸臨床機理研究。通訊作者：張莉，女，博士，教授，博士生導師。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.03.004